1. 이끄는 말
모든 분야가 명백한 구분이 없이 서로 연결고리를 가지고 관련을 맺고있기 때문에 명확한 학문의 영역으로 나눌 수 없다. 운동선수들의 약물복용을 검사하는 도핑 테스트에서도 마찬가지로 화학, 생물학, 약학, 의학 분야가 연결되어있으며 이 가운데서 화학의 분석화학 분야가 깊이 관련되어 있다. 이와 관련하여 본란에서는 금지약물 복용을 검사하는 방법을 소개함으로써 얼마만큼 화학이 이 분야에서 중요한 부분을 차지하고 있는지를 살펴 보고자한다.
인류의 역사는 전쟁이나 운동경기에서 힘과 경기력을 향상시켜서 남을 이기기 위한 각고의 노력으로 이루어진 역사라고 할 수 있을 것이다. 오늘날 'doping'이라 불리는 행위도 이 역사와 함께 하고 있으며 이를 방지하고 감시하는 노력도 함께 되어 오고 있다. 도핑은 다음과 같이 정의되고 있다. "Doping is defined as the administering or use of substances in any form alien to the body or of physiological substances in abnormal amounts and with abnormal methods by healthy persons with the exclusive aim of attaining an artificial and unfair increase of performance in competition. Furthermore various psychological measures to increase performance in sports must be regarded as doping."
즉, "경기력을 향상시키기 위하여 의도적으로 약물을 복용하거나 비정상적인 방법으로 사용했을 경우"를 말한다.
B.C. 3세기 말엽에 고대 올림픽 경기에서도 mate, tea, coffee에서부터 strychinine, cocaine 같은 흥분제(stimulants) 등 가능한 수단을 사용하여 경기력을 향상시키려고 했던 기록이 존재한다. 1960년 로마 올림픽 게임에서 덴마크의 자전거 선수가 암페타민과 니코틴산을 복용하고 출전하였다가 사망한 것을 계기로 1968년 프랑스 그레노블에서 열린 동계 올림픽 때부터 정식으로 도핑콘트롤을 시작하였다. 이때는 몇 가지의 흥분제와 마약류에만 국한하여 약물 검사를 하였으나 점차 금지 약물의 대상이 증가되어 현재 국제 올림픽위원회에서 규제하는 약물은 크게 6종류로 나눌 수 있다. 1) 속칭하여 히로뽕이라 불리는 암페타민이나 카페인 같은 흥분제류, 2) 모르핀 및 헤로인 등의 마약류, 3) 심장 박동을 느리게 하는 메토프롤롤 같은 베타-차단제류, 4) 근육을 강화시키는 스테로이드류, 5) 체중 감량이나 다른 약물 농도를 희석시키는 이뇨제류 및 6) 기타 호르몬제 등 총 110종의 약물을 선수들의 소변에서 검사하고있으며 계속해서 금지 대상 약물이 증가하고 있는 추세이다. 우리 나라에서는 1986년 아시아경기대회와 1988년 서울올림픽 게임을 계기로 도핑테스트가 일반인들에게 알려지기 시작하였으며 최근에는 1994년 월드컵 축구경기에서 축구의 달인이라는 마라도나의 약물복용 사건 등에서 보여준 바와 같이 경기력 향상을 위한 선수 및 주변인들의 집념은 끝이 보이지 않는다. 그리고, 현대에 와서는 스포츠가 상업화가 되면서 두각을 나타내는 선수는 선수 자체가 웬만한 기업에 못지 않은 상업도구가 되어있으므로 선수에 연결되어있는 사람(매니저, 코치, 트레이너, 의사, 또는 물리 요법사)들이 선수의 경기력 향상을 위하여 선수도 모르게 약물을 투여하게 되어서 선수는 자의적 또는 타의적으로 doping에 관련하게 되었다. 또한 약물복용을 피하기 위한 여러 가지 의학, 약물학적 수단과 방법을 추구하는 운동선수들에 대항하여 약물검사 방법도 새로운 분석기술도 개발되어야 하는 양자간에는 쫓고 쫓기는 관계를 가지고 있다.
2. 도핑검사의 필요성
국제올림픽조직위원회(IOC)의 의무분과위원회(MC)에서는 두 가지 측면에서 운동선수들의 약물사용을 금지하고 있다. 첫째, 의학적인 측면에서 약물복용으로 인하여 신체의 조직을 변화시키는 정도의 효력이 있는 물질들은 인체에 물리적 또는 정신적인 해를 가져오기 때문이며, 둘째, 윤리적인 측면에서 경기력 향상을 목적으로 금지된 약물을 사용함으로써 정당하고 공평한 경쟁이 요구되는 올림픽의 기본 정신에 위배되어 약물복용을 하지 않는 선수에게 불리한 결과를 가져오기 때문이다. 현재는 우리 나라에서 열리는 각종 국제경기에서도 약물복용을 금지하고 있다.
3. 약물검사 과정
각종 경기단체와 IOC에서 실시하는 약물검사는 경기가 끝난 후 개인 경기 종목에서는 상우 입상자를 상대로 시료(소변)을 채취하며 단체경기의 경우는 무작위 추출해서 소변을 채취한다. 그러나 최근에는 약물검사가 강화되어서 세계반도핑기구(WADA)에서는 각 경기단체 및 국가올림픽위원회의 허락없이도 훈련중인 선수들을 상대로 경기외 (out-of-competition)에도 불시에 시료채취가 이루어지고 있다.
ㄱ. 약물검사를 위해서는 현재까지는 경기자의 소변에 대해서만 행해지고 있으며 승마경기의 경우에는 경기자와 경기 말의 소변을 취하게 되는데 한 세트의 병A에는 50㎖, 병B에는 25㎖이 최소한 채워져야 한다.
ㄴ. A시료를 개봉해서 분석실험을 실시하고 B시료는 냉동실에 보관한다.
ㄷ. 만약 A시료 분석결과가 양성으로 나타나면 경기단체에 통보해서 선수본인, 코치, 혹은 담당의사의 입회 후 B시료 분석한다.
ㄹ. 만일 B시료 분석에서도 양성이 나오면 최종적으로 양성반응 통보를 하게된다.
이와 같이 시료채취에서부터 분석까지는 재현성이 요구되기 때문에 숙련된 실험자가 필요하며 좋은 분석장비가 요구된다.
4. 도핑검사에서 사용되는 분석 장비
기체크로마토그래피(GC), 액체크로마토그래피(HPLC), 기체크로마토그래피(GC)/질량분석기(MS), 고 분해능 질량분석기(high resolution mass spectrometer) 등의 유기 화학물질 분석 장비가 사용되고 있는데 이들 장비는 고감도 장비이며 고가의 장비이기 때문에 유지관리에 심혈을 기울여야한다. 분석에 관여하는 실험자는 숙련된 추출기술, 유도체화 방법 및 기기 사용 기술이 필요하다.
4.1. 기체크로마토그래피(Gas chromatography, GC)
기체크로마토그래피는 비교적 휘발성이 큰 혼합물질을 분석관에서 물질의 성질에 따라 분리하는 기기로써, 도핑 관계되는 약물들 중에서 질소 원소가 포함된 약물들을 검출하는데 이용되므로 검출기는 질소함유물질에 선택성이 있는 nitrogen-phosphorous detector (NPD)를 사용하며 이동상 기체로는 주로 헬륨을 사용한다.
4.2. 액체크로마토그래피(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)
기체크로마토그래피로 분석이 힘든 비교적 휘발성이 좋지 않고 열적안정성이 좋지 않기 때문에 GC로 분석하기 힘든 물질을 분석하는데 이용되며 검출기로는 diode array detector (DAD)를 이용한다.
4.3. 질량 분석법 (Mass spectrometry)
질량분석법은 매우 감도가 높으며 화합물의 구조를 파악할 수 있는 특징이 있다. 질량 스펙트럼은 시료를 빠르게 움직이는 이온(보통 양이온)으로 만들어서 질량대 전하비에 따라 이들 이온을 분리함으로써 얻을 수 있다. 질량 분석법은 화합물을 이온화시키면 이때 어미 화학종이 특유한 질량분포를 갖는 것에 기본을 두고 있다. 이때 얻은 질량 스펙트럼은 화학구조를 밝히는데 유용하게 이용된다. 질량스펙트럼 정보는 시료의 구성성분 원자단의 질량에 관한 정보를 알려주며 분석물질의 분자량을 이 방법으로 얻을 수 있다. 질량 스펙트럼은 또 복잡한 혼합물의 질량분석에 이용할 수 있다. 이때 여러 가지 질량에서 나타나는 이온 전류의 크기는 시료 농도와 관계를 갖는다. 질량 분석기는 시료 도입장치, 이온화장치, 질량여과장치, 검출장치, 신호처리 장치 등으로 이루어져 있으며 전체 내부장치는 낮은 압력(약 10-6 torr)을 유지시켜야 한다. 시료의 상태는 이온화장치와 종류에 따라 다를 수 있으며 전자충돌(electron impact)의해 이온화하는 방법이 가장 보편적인 방식이다. 질량여과장치로는 자기장, 전기장을 이용하는 방식(sector형), 비행시간 분석계(time of flight, TOF) 및 사중극자 분석계(quadrapole)등이 사용될 수 있다. 일반적인 screening에서는 사중극자 질량분석계를 사용하며 '96년 Atlanta 올림픽 부터는 스테로이드의 정확한 분석을 위해서 sector형 고분해능 질량분석기(high resolution mass spectrometer)를 사용하고 있으며 국내에서도 사용하고 있다.
5. 금지약물의 종류 및 분석방법
5.1.0. 흥분제(Stimulants)
운동선수들이 흥분제를 복용하게 되면 피로를 덜 느끼게 되고, 감각이 예민해지고, 정신운동이 활발하게 되어 경기력의 향상에는 도움이 되지만 과용하게 되면 과민성, 호전성, 그리고 심장병 등의 심한 부작용을 나타내게 되므로 이들 약물들은 선수들의 건강보호 측면에서뿐만 아니라, 윤리적인 측면에서 경기력을 향상시키기 때문에 운동선수들에게 금지약물로 규정하고 있다. 일반 약이나 음료수중에 포함되어 있는 흥분제들은 허용기준을 규정하고 있다. 흥분제중 ephedrine류는 감기 약에 들어있는 주성분이므로 소변에서의 허용 농도 기준을 ephedrine과 norpseudoephedrine인 경우는 5ppm, pseudoephedrine과 norephedrine은 10ppm으로 규정하고 있다. Caffeine은 커피나 일반음료수에 들어있는 성분이기 때문에 소변에서의 농도가 12ppm 이하인 경우는 허용이 되지만 그 이상의 농도가 되면 고의적인 약물복용으로 판정하고 있다. 2002년 2월 현재 국제올림픽위원회(IOC) 의무분과위원회에서 발표한 흥분제계통의 금지약물은 amfepramone(diethylpropion), amineptine, amiphenazole, amphetamine, bambuterol, bromantan, bupropion, caffeine, carphedon, cathine(norpseudoephedrine), cocaine, cropropamide, crotethamide, ephedrine, etamivan, etilamphetamine, etilefrine, fencamfamine, fenetylline, fenfluramine, formoterol, heptaminol, mefenorex, mephentermine, mesocarb, methamphetamine, methoxyphenamine, methylendioxyamphetamine, methylephedrine, methylphenidate, nikethamide, norphenfluramine, parahydroxyamphetamine, pemoline, pentetrazol, phendimetrazine, phentermine, phenylephrine, phenylpropanolamine(norephedrine), pholedrine(p-OH-methamphetamine), pipradrol, prolintane, propylhexedrine, pseudoephedrine, reproterol, salbutamol(albuterol), salmeterol, selegiline, strychnine, terbutaline 등 50여종이며 이들은 몇 종만 제외하고는 모두 다음 실험방법에 의해서 검출이 가능하다.
5.1.1. 시료 전 처리
소변 5ml을 취하여 20㎖ tube에 넣은 후 5N KOH용액 0.5㎖를 넣어서 pH를 14이하의 염기성 상태로 만든 후 sodium sulfate 3g 넣고 diethyl ether 2㎖ 사용하여 추출한 후 GC/NPD와 GC/MS에 주입한다.
5.1.2. 분석장비
흥분제 약물들은 대부분 질소원소를 포함하고 있으며 비교적 휘발성이 큰 물질들 이므로 분석 기기로는 gas chromatograph(GC)/NPD와 gas chromatograph / mass spectrometer(GC/MS)를 사용한다. column은 5% diphenyl-dimethlysiloxane으로 중간정도의 것이며 길이가 17m, film thickness가 0.33㎜, 내경이 0.2㎜인 것을 사용한다. 주입구 온도는 290℃, 검출기 온도는 300℃, 이동상 기체는 헬륨으로써 1.0㎖/min 유속이며, auxiliary gas는 30㎖/min(He), 수소는 3㎖/min, air는 70㎖/min, split ratio는 10:1이다. 컬럼의 초기 온도는 100℃이며 20℃/min속도로 증가시켜서 마지막 온도는 300℃이고 이 온도에서 5분간 유지시킨다. GC/MS의 경우 GC의 조건은 위의 조건과 동일하며 질량 범위가 m/z 40-450이고 scan mode에서 사용한다.
GC와 GC/MS는 극미량의 여러 혼합물을 분리해서, 정량, 정성 하는데 가장 유용하게 사용되는 기기이며 표준 물질과 머무름 시간을 비교하여 일차적으로 screening하고 질량 스펙트럼을 비교해서 물질을 확인한다.
5.2.0. 마약성 진통제(Narcotic Analgesics)
마약성 진통제는 morphine의 기본구조를 가지고 있는 약물들이 주류를 이루고 있고 그 외에 methadone, pethidine과 같은 합성약물들이 있으며, 이들은 의식을 잃지 않는 상태에서 통증과 불안을 해소시키고 쾌감과 진정을 초래하기 때문에 운동선수들에 의해서 복용되고 있다. 이들 약물들은 경기를 하는 동안 선수가 통증을 느끼지 못하기 때문에 심각한 부상을 당하게 될 위험이 있을 뿐만 아니라, 자주 복용하게 되면 만성중독의 위험이 있기 때문에 국제올림픽위원회(IOC)를 비롯한 각 경기연맹에서는 마약성 진통제의 복용을 금지하고 있다. stimulants와 narcotic analgesics중 비교적 heavy volatile한 화합물로서 cocaine, anileridine및 morphine류 등이 있다. 이들은 대부분이 체내에서의 대사과정을 통하여 conjugated form으로서 뇨로 배설되기 때문에 가수분해 과정 거친 후 유기용매로 추출한다. 또한 이들 약물들은 극성이 큰 hydroxyl(-OH)기를 가지고 있으므로 일반적인 비극성 column에 대한 chromatographic 성질이 좋지 않으며 active hydrogen을 포함하고 있는 amine기는 질소원자가 가지고 있는 비공유 전자쌍 때문에 column내에서 흡착 현상이 일어나 chromatogram상에서 peak tailing을 유발하게 된다. 이와 같은 문제점들을 해결하기 위하여 active hydrogen을 가지고 있는 hydroxyl기를 적당한 유도체화 시약을 사용하여 유도체로 만들어 주면 분자들의 극성이 감소할 뿐 아니라, 분리관에 대한 흡착현상이 감소되어 GC에 대한 성질이 좋아진다. Beta-blockers도 대부분이 conjugated form으로 배설될 뿐만 아니라, hydroxyl기와 amine기를 가지고 있으므로 같은 방법으로 분석한다. 복용이 금지된 약물로는 buprenorphine, dextromoramide, diamorphine(heroin), hydrocodone, methadone, morphine, pentazocine, pethidine등이 있으며 다음과 같은 실험방법으로 검출한다.
5.2.1. 시료 전처리
15㎖ 원심 분리 관에 뇨 5㎖를 취한 후 진한염산 1㎖및 cysteine 약 100㎎을 첨가한다. 이 혼합물을 105℃에서 30분동안 가열하여 glucuronide conjugated 약물들을 가수분해시킨다. 가수분해된 시료를 상온에서 냉각시킨 후 추출용매 diethyl ether 5㎖를 넣어서 추출하고 원심 분리시켜 ether층을 제거하고 남아있는 수층에 내부표준물질을 첨가한 후 미리 준비된 borate buffer용액을 사용하여 pH가 9.6이 되도록 조절한다. 그리고 추출 수율을 높이기 위하여 tert-butanol/water (90:10) 0.5㎖를 가한 다음 유리마개로 막은 후 몇 초 동안 진탕시켜준다. Peroxide와 수분을 제거한 diethyl ether 5㎖와 anhydrous sodium sulfate 3g을 시료에 첨가하여 추출하여 diethyl ether층을 감압증발기나 질소증발기를 사용하여 용매와 수분을 완전히 제거한다. 얻어진 잔류물에 methylorange-CH3CN/CF3CO2H 혼합용액 50㎕를 첨가하여 다시 녹인 후 이 용액에 MSTFA를 붉은 색에서 노란 색으로 변할 때까지 가한다. 이 반응 혼합물을 80℃에서 5분 동안 가열한 후 MBTFA 10㎕를 가하고 다시 80℃에서 10분 동안 가열해서 유도체화 반응을 완결한 후 GC/MS에 주입하여 분석한다.
5.2.2. 분석장비
Quadrupole mass filter가 달린 GC/MS와 이온화 방법은 전자 충격법(EI)을 사용하고 column은 5% diphenyl-dimethlysiloxane을 사용한다. oven의 초기온도는 1,640℃ 이며 20℃/min으로 승온하여 300℃에서 3분간 머무르게 한다.
5.3. 근육 강화제(Anabolic Steroids)
근육 강화제는 남성호르몬인 testosterone의 유도체들로서 이들은 모두 금지약물로 규정되어있다. 근육 강화제를 복용하게 되면 체내 단백질합성을 증진시켜 근육이 증강되고 힘과 지구력이 증가되어 운동 경기력이 향상된다. 또한 근육 강화제가 자신들의 경쟁심을 불러일으키는 역할을 한다고 확신하기 때문에 운동선수들에 의해 남용되고 있다. 그러나 힘과 지구력을 향상시킨다고 하더라도 이들로부터 간 장애, 생식기 및 정신장애, 여성의 남성화 등의 부작용이 있기 때문에 금지약물로 규정하고 있다. 남성의 경우 본래 체내에 testosterone이 존재하므로 고의적인 복용여부를 판정하기 위해서 소변내의 testosterone과 그 epimer인 epitestosterone의 비율(T/E ratio)로 판정하고, 약물검사결과 그 값이 6이상이면 testosterone양성으로 간주된다. 일반적으로 약물을 남용하는 선수는 훈련기간 중에 약물을 투여 받으며 경기 몇 주일 전에 약물복용을 중단하면 경기 당일의 혈액이나 소변 내에서 그 농도가 거의 0이 된다. 그런 까닭에 경기 당일에는 물론 훈련기간 중에도 스테로이드의 사용을 금지해야 하나 훈련기간중의 통제는 수행하기 어려운 실정이다. 그러므로 검출한계를 낮추어서 가능한 훈련기간중의 투여를 잡아낼 수 있도록 해야 한다. 많은 스테로이드들이 분석되어지면서 스테로이드의 약물반응 속도론과 분석의 감도면에서 많은 발전이 이루어졌으며 screening에서는 GC/MSD를 이용하며 최근에는 GC/HRMS를 사용하여 검출한계를 낮추고 있고 정확성도 높이고 있다. 금지약물로는 androstenediol, androstenedione, bambuterol, boldenone, clenbuterol, clostebol, danazol, dehydrochlormethyltestosterone, dehydroepiandrosterone(DHEA), dihydrotestosterone, drostanolone, fenoterol, fluoxymesterone, formebolone, formoterol, gestrinone, mesterolone, metadienone, metenolone, methandriol, methyltestosterone, mibolerone, nandrolone, 19-norandrostenediol, 19-norandrostenedione, norethandrolone, oxandrolone, oxymesterone, oxymetholone, reproterol, salbutamol, salmeterol, stanozolol, terbutaline, testosterone, trenbolone등이 있으며 다음과 같은 실험을 통해서 검출한다.
5.3.1. 시료 전 처리
스테로이드는 분자내의 극성 작용기인 hydroxyl기, carboxyl기, 또는 amine기 등을 갖고 있으므로 이들 작용 기에 의해 GC에 대한 성질이 좋지 못하다. 따라서 이들 작용기들을 극성이 적은 다른 작용기로 치환하는 유도체화 방법을 써야 한다. 또한 소변 내에 존재하는 steroid들은 free한 상태뿐만 아니라 conjugate된 상태로도 존재한다. Conjugate들은 주로 glucuronide들이며 sulfate들도 소량 존재한다. Conjugated steroid들을 직접 분석하기도 어렵고 그럴 필요도 없으므로 이들은 유도체화 과정 이전에 free한 상태로 만들어야 한다. 그 과정이 가수분해 과정이며 효소를 이용하여 가수분해한다. 효소가 가수분해 반응을 일으킬 때 반응계 내에 극성이 큰 분자들이 방해를 일으키므로 가수분해 효율을 높이기 위해서 solid extraction을 미리 거치며 전 처리 방법을 소개하면 다음과 같다.
먼저, 유리관(내경 0.5㎝)에 glass bead를 넣어서 아래부분을 막은 다음, 충분히 세척된 XAD-2 resin을 높이 2㎝ 정도로 채워서 만들고 5㎖ 소변을 loading 시킨 후 동량의 증류수로 resin을 씻어주고 1㎖의 methanol로 3번 추출한 후 용액을 건조시킨다. 건조된 잔유물에 phosphate buffer 1㎖, -glucuronidase(200U/㎖) 25㎕를 넣고 50 ℃에서 1시간동안 가수분해시킨다. 가수분해시킨 후 potassium carbonate 100㎎을 넣어 pH를 조절하고 diethyl ether 5㎖를 사용하여 추출한다. Diethyl ether층은 수분까지 완전히 건조시킨다. MSTFA/TMSI(1000:2) 혼합용액 100㎕를 steroid를 추출한 원심분리 tube에 넣고 60℃에서 15분간 반응시킨 후 유도체화 반응이 완결되면 GC/MS에 주입해서 분석한다.
5.3.2. 분석 장비
본 실험에서 사용하는 분석 기기로는 GC/MSD이며 더 정확한 분석을 위해서는 분해능이 3000이상의 고 분해능 질량 분석기를 사용하고 있는 추세이다. 컬럼은 정지상이 SE-30이며 길이가 17m이며 SIM(selected ion monitoring)방법으로 screening한다.
5.4. 베타-차단제(Beta-Blockers)
베타-차단제를 복용하게 되면 혈압이 내려가고 맥박 수를 감소시켜 운동선수에게는 안정제의 역할을 한다. 베타-차단제는 경기력 향상에는 효과가 없으나 정신적인 안정 및 호흡조절과 관련 있는 운동경기인 사격이나 양궁, 체조 등의 경우 IOC와 각 경기연맹에서는 복용을 금지하고 있다. 금지약물은 acebutolol, alprenol, atenolol, betaxolol, bisoprolol, bunolol, carteolol, celiprolol, esmolol, labetalol, levobunolol, metipranolol, metoprolol, nadolol, oxprenolol, pindolol, propranolol, sotalol, timolol 이 있으며 이 약물에 대한 분석법은 마약성 진통제의 분석법과 동일하다.
5.5. 이뇨제(Diuretics)
이뇨제는 짧은 시간 내에 소변의 생성속도를 증가시켜 소변의 배설 량을 증가시키는 역할을 하는 약물이다. 선수들이 이뇨제를 오용하는 이유는 두 가지가 있다. 첫째, 레슬링, 역도, 권투 등의 체급경기에서 체중을 급하게 줄이기 위해서이고, 둘째, 소변의 배설 량이 짧은 시간 내에 증가되어 소변 안에 들어 있는 약물의 농도를 감소시켜서 오용된 약물의 검출을 피하기 위해서이다. 운동경기에서 짧은 시간 내에 체중을 감소시키는 행위는 의학적으로 정당화될 수 없고, 또한 이뇨제를 복용하게 되면 탈수, 근육경련, 혈압강하 및 전해질 불균형등 심각한 부작용을 초래한다. 더구나 낮은 체급으로 경기를 하기 위해 인위적으로 체중을 줄이거나 소변에서의 약물검출을 피하기 위해 소변의 희석효과를 노리는 시도는 도덕적으로도 용납될 수 없는 행위이다. 그러므로 이뇨제를 금지약물로 규정하고 있다.
금지된 약물 중에서 휘발성이 작거나, 열적 안정성이 낮고, 극성 기를 가지고 있어서 GC성질이 좋지 않은 약물들은 HPLC(high performance liquid chromatography) / DAD(diode array detector)를 사용하여 분리 및 검출할 수 있다. 이 방법으로 검정하는 약물들은 stimulants로는 caffeine, pemoline이며 diuretics는 acetazolamide, bendroflumethiazide, bumetanide, canrenone, chlortalidone, ethacrynic acid, furosemide, hydrochlorothiazide, indapamide, mannitol(by intravenous injection), mersalyl, spironolactone, triamterene 등이다. 뇨로부터 이와 같은 약물을 동시에 분석하기는 매우 어려운 일이다. 이 약물들을 뇨로부터 추출하려면 각 약물의 pKa값이나 용매에 대한 용해도 등의 이화학적 성질에 따라 여러 가지 추출조건으로 추출해야만 한다. 그러나 짧은 시간 내에 많은 시료를 분석하기 위해서는 각 약물을 동시에 효과적으로 추출 할 수 있는 방법이 요구된다. 그래서 추출효율도 양호하고 HPLC/DAD에 의한 분리에서 방해물의 봉우리도 크지 않은 액체-액체 추출 법을 사용한다. 추출된 시료는 HPLC/DAD로 분석하여 그 머무른 시간과 UV스펙트럼을 얻고 이를 표준물질과 비교한다.
5.5.1. 시료 전 처리
뇨 3㎖을 15㎖용량 원심 분리 관에 넣고 내부 표준물질인 ethyltheophyline이 5㎍/㎖이 되도록 첨가하고 pH 7로 조절한 다음 diethyl ether 5㎖을 넣고 무수 황산나트륨 0.5g를 첨가하여 진탕 기에서 10분간 흔들어 약물을 추출한다. 이것을 원심분리하여 유기용매층을 취하고 회전진공 증발기로 용매를 날려보낸다. 잔유물을 methanol 200㎕에 녹여서 HPLC에 주입하여 분석한다.
5.5.2. 분석장비
본 실험에서 시료의 분리에는 역상(reverse phase)방법을 사용하므로 비극성 column인 C18 (100 * 4.6㎜ I.D.,5㎛)을 사용하고 이동상은 인산염 완충액 (pH 6.7∼6.8)과 acetonitrile을 사용하고 l.0㎖/min.의 유속으로 흘려준다. 이동상의 조성은 초기에 4% acetonitrile에서 4분 동안 10%로 증가시키고 다음 6분 동안 40%로. 그 다음 3분 동안 60%로 증가시켜 마지막 5분간 그대로 유지하도록 하는 기울기 용리법(gradient method)을 사용한다. 검출기는 DAD(diode array detector)로서 caffeine은 220nm및 273nm, pemoline은 220nm로 monitor하였고 이뇨제는 물질마다 다양한 UV 흡수형태를 나타내므로 220, 273, 328nm 등으로 monitor한다.
6. 펩타이드호르몬과 그 유사체들(Peptide Hormones and Analogues)
펩타이드호르몬은 한 장기에서 다른 장기로의 전달자 역할을 해서 성장을 자극하거나 성적인 충동에 영향을 주고 자연적인 진통효과를 나타낸다. 그 유사체들은 주로 화학적인 합성에 의해 만들어지는데 이미 존재하는 펩타이드 약물과 비슷한 효과를 나타낸다. IOC로부터 금지된 것으로는 인체 융모성 성선자극호르몬(HCG, human chorionic gonadotropin), 부신 자극호르몬(ACTH, corticotropin) ,성장호르몬(growth hormone), erythropoietin(EPO)등을 들 수 있다. 이러한 약물의 모든 호르몬방출인자들도 또한 금지되어 있다. HCG나 이와 유사한 효과를 갖는 약물을 남성에게 투입하게되면 체내 내인성 동화 스테로이드의 합성을 증진시켜 체외에서 남성호르몬을 주입하는 것과 같은 효과를 나타내고, ACTH는 혈액내의 내인성 부신피질호르몬의 양을 두드러지게 증가시켜 부신피질호르몬과 동일한 효과를 나타내므로 이와 같은 펩타이드호르몬들을 금지약물로 규정하고 있다
7. 혈액도핑(Blood Doping)
혈액도핑은 혈액이나 적혈구, eryhropevetine과 같은 혈액관련의약품을 질병치료를 위한 목적이 아니라 경기력의 향상을 위해 운동선수들에게 투여하는 것이다. 혈액도핑에는 혈액을 체내에 정맥 주사한 것도 포함되며, 경기 전에 그 운동선수 또는 다른 운동선수로부터 뽑았던 혈액을 다시 수혈하는 것도 혈액도핑에 해당한다. 혈액도핑의 경우 만일 적절한 혈액이 사용되지 않을 경우 알레르기반응과 신장이상을 초래하는 급성용혈 반응을 유발할 수 있다. 또한 수혈에 대한 반응이 늦게 나타날 경우 열이나 황달을 초래하며 간염이나 에이즈(AIDS)와 같은 감염성질환, 그리고 순환계에 대한 과중대사성 쇼크도 유발시킬 수 있다. 그러므로 윤리적인 측면과 건강에 대한 심각한 위험 때문에 IOC의무분과위원회에서는 혈액도핑을 금지하고 있다
이외에 IOC에서는 약물검사에 사용되는 소변시료의 본질을 변형시키는 물질이나 방법을 금지하고 있다. 예를 들면 소변을 다른 사람의 소변으로 바꾸거나 소변의 신장배설을 억제하는 약물, 즉 프로베네시드(probenecid)의 복용이 여기에 속한다.
한편, 알코올은 금지약물로 규정되어 있지는 않지만 각 경기연맹에서 검사를 요구 할 경우
호흡이나 혈액내의 알코올농도를 측정하여 알코올의 복용여부를 결정한다. 알코올은 가장 많이 오용되는 약물중의 하나이지만 일반적으로 경기력을 향상시키는 효과는 없고, 다만 중추신경의 기능 및 판단력을 감소시키므로 금지약물로 분류되지 않는다. 마찬가지로, 마리화나(Marijuana, 대마초)는 일반적으로 경기력을 향상시키는 효과는 없으므로 IOC 금지약물목록에는 없다. 그러나 특별한 경기에서 그 연맹이 요구하면 검사의 대상이 된다. 또한 마리화나의 사용은 불법이며 즉시 체포의 대상이 된다. 그리고 국소마취제(Local Anesthetics)는 어떤 경우에는 일부 마취제의 복용이 허용되지만 금지약물의 성분을 포함하는 국소마취제의 경우는 금지 되어있다. procaine, xylocaine, carbocaine 등은 사용할 수 있지만 코카인(cocaine)은 사용할 수 없다. 인체 내에서 만들어지거나 인위적인 합성에 의해 만들어진 부신피질호르몬(corticosteroids)은 통증을 완화시키는 소염제로서 사용된다. 이 약물은 체내에서 내인성 부신피질호르몬의 순환농도에 영향을 미치고, 환각에 가까울 정도의 유쾌한 상태를 나타내므로 국소적으로 사용될 때를 제외하고는 반드시 의사의 지시에 따라 복용해야 한다. 경구투여 또는 근육주사 및 정맥주사에 의한 투여는 금지되어 있다. 그러나 눈, 귀, 피부 등에 대한 국소적인 사용, 천식 및 알러지성 비염 등의 치료를 위한 흡입요법, 그리고 국소적 또는 관절내주사 등은 허용되어있으며 단, 담당의사가 IOC의무분과 위원회나 각 경기연맹에 서면으로 미리 보고하는 경우에만 가능하다.
우리나라 선수들이 보약으로 많이 복용하고 있는 한약에도 금지약물이 함유되어 있으므로 이에 대한 주의가 필요하다. 예를 들면, 한약제 중에서 마황과 반하에서는 흥분제 계통의 금지약물인 ephedrine, pseudoephedrine, norpseudoephedrine, methylephedrine등이 검출되며 커피와 차엽에서는 caffeine, 마전자에서는 strychnine이 검출 된다. 솔감탕에는 마황이 들어있기 때문에 ephedrine이 검출된다. 마약류로는 아편에서는 codeine과 morphine이 검출되고 코카엽에서는 cocaine이 검출된다. 한편, 현재까지는 한약제중에 금지된 근육 강화제와 베타 차단제는 포함되어 있지 않다.
7. 맺는 말
세계 육상계의 거물이었던 벤 존슨의 약물복용을 밝혀냄으로써 세계를 떠들썩하게 했던 '88 서울올림픽게임을 성공적으로 마친 후 약물검사라는 초 미량 분석 기술은 국내. 외의 관심사가 되어온 식품중의 잔류농약 및 독성 물질 검출, 체내, 공기, 식품 포장재 및 수돗물 등에 존재하는 잔류 유기용제(VOCs), 의학에 있어서 질병진단과 치료에 필수적인 biomarker screening, 신약개발에 필요한 대사체 규명, 우리 나라의 환경분야에서 가장 이슈거리가 되고 있으며 분석이 까다롭기로 소문난 dioxin 분석, 생명공학(BT) 분야의 프로테오믹스(proteomics), 메타볼로믹스(metabolomics)등에서 펩타이드 및 단백질의 구조규명과 관련한 생체고분자 분석, 체내 대사경로확인등 각 분야에 필요한 유기화합물 분석에 있어서 응용되고 있다. 이상에서 살펴본 바와 같이 화학 특별히, 분석화학이 약물검사에서 중요한 위치를 차지하고 있다는 사실과 더불어 다른 산업분야에서도 얼마나 중요한가를 앎으로써 화학인 들이 사회에 대한 책임감을 느끼면서 배가의 노력을 기울여함을 깨닫게 한다.