<P>검색해봤는데 제가 궁금해하는 부분을 질문하신 분은 없어서 질문을 올립니다.<BR><BR>RNase protection assay 실험 막바지에<BR>Proteinase K와 10% SDS를 10분간 처리한다고 하는데<BR>Proteinase K가 RNase를 분해하고 10% SDS가 분해된 RNase에 - charge를 붙이는건가요?<BR>SDS-PAGE하듯이?<BR>그리고 굳이 RNase를 제거하려 위의 두 물질을 첨가할 필요가 있나요?<BR>이 과정 없이 그냥 전기영동해버리면 단백질이 ds RNA가 이동하는 걸 막아서<BR>밴드를 제대로 관찰할 수 없게 만들어서 그런건가요?<BR><BR><BR><BR>DNA microarray 과정 필기에서 처음에 random ss DNA 합성 또는 mRNA와<BR>동일한 서열의 ss DNA 합성해서 chip에 심는다고 되어있는데 그냥 genomic DNA<BR>절편화해서 ss로 chip에다 심는거 아닌가요? <BR><BR></P>
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<P>enhancer trap 말인데요 t-dna나 전이인자가 무작위로 들어가는 거잖아요<BR>뭔가 실험을 확실하게 할 수 있을만한 처리 방법은 없나요? 무작위로 들어가게 하려면<BR>시간도 걸릴테고 특정유전자 사이로 들어가 유전자를 망가뜨릴수도 있고 <BR>그리고 예로 드신 쥐나 원숭이 보면 쥐 실험결과 그림을 봤을 때 리포터 유전자를<BR>다량 넣는거 같은데 혹시나 그 리포터가 다른 곳에도 들어간다면 내가 원하는 유전자의<BR>발현위치만 알 수 없게 되지 않나요?<BR>그리고 원숭이 같은 경우도 몸 전체에 리포터 유전자가 여기저기 삽입되면 얼굴에서만<BR>발현되는지 어떻게 알죠? </P>
<P>그러니까 내가 어떤 서열의 유전자의 발현 위치가 어딘지 알고 싶다 해서</P>
<P>그 유전자 옆에 리포터 유전자를 삽입하지 않는 이상 이 유전자는 얼굴에서만 발현된다</P>
<P>뭐 이런식으로 결과를 얻는건 힘들거 같은데요 </P>
<P>그리고 insulator 개념은 이런 방식으로 enhancer가 작용하므로 enhancer trap을 이용할 수 </P>
<P>있다는걸 보기 위한거죠? 실험할 때 insulator까지 짜넣는건 아니죠?</P>
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첫댓글1. RNaseprotection assay RNase가매우 안정해서 변성을 시키려면 단백질 분해효소만으로는 불충분해서.. SDS를 넣어주지 않았을까요..(total RNA추출 시 Rnase를 변성하기위해 산성페놀에, 구아니디움아이오다이드와 같은 강력한 단백질 변성제처리한 것 처럼) 2. 14장 DNA microarray는 mRNA의 발현량을 확인하고 싶은 거니까 그것과 상보적인 cDNA를 합성해서 칩에 심어줘야 더 잘 결합하지 않을까요. 조사하고자 하는 mRNA도 양을 증폭시켜주기위해 cDNA로 합성하구요..
답변 잘 해 주셨습니다. 2. genomic DNA에는 실제 발현되지 않는 불필요한 서열들이 많죠. 쓸데없는 서열들로 칩을 만들 필요는 없습니다. 3. 이미 이론 수업에서 자세히 설명드린 부분입니다. 2권 16장에 보면.. T-DNA의 삽입 위치를 확인할 수 있는 실험 방법이 나와 있습니다. 무작위로 삽입된 DNA 절편이 최종 어느 유전자 옆에 삽입되었는지 확인하면 됩니다. 그리고 정확하게 특정 유전자 옆에 리포터를 넣는 방법보다 무작위로 실험하는 것이 실제 실험실에서 해보면 훨씬 더 시간이 절약된다는 부분도 설명해 드린 바 있네요. 또 리포터가 원래 세포에서 주변 유전자가 어느 부위에서 발현되는지를 가르쳐 주는 유전자입니다.
랜덤하게 리포터가 삽입된 여러 원숭이 중에서 어떤 특정 원숭이의 얼굴에서 리포터가 발현되고 있으면... 그 주변 유전자가 얼굴에서 발현되는 유전자라고 유추되는 겁니다. 마지막으로 insulator는 원래 생물체의 염색체에 들어 있는 겁니다. 따로 넣어주는게 아니죠. 아무튼 이론 수업 내용들을 다시 잘 정리하시기 바랍니다.
첫댓글 1. RNaseprotection assay
RNase가매우 안정해서 변성을 시키려면 단백질 분해효소만으로는 불충분해서.. SDS를 넣어주지 않았을까요..(total RNA추출 시 Rnase를 변성하기위해 산성페놀에, 구아니디움아이오다이드와 같은 강력한 단백질 변성제처리한 것 처럼)
2. 14장 DNA microarray는 mRNA의 발현량을 확인하고 싶은 거니까 그것과 상보적인 cDNA를 합성해서 칩에 심어줘야 더 잘 결합하지 않을까요. 조사하고자 하는 mRNA도 양을 증폭시켜주기위해 cDNA로 합성하구요..
제 생각입니다. 선생님께서 잘 정리해주실꺼에요~~!
답변 잘 해 주셨습니다. 2. genomic DNA에는 실제 발현되지 않는 불필요한 서열들이 많죠. 쓸데없는 서열들로 칩을 만들 필요는 없습니다. 3. 이미 이론 수업에서 자세히 설명드린 부분입니다. 2권 16장에 보면.. T-DNA의 삽입 위치를 확인할 수 있는 실험 방법이 나와 있습니다. 무작위로 삽입된 DNA 절편이 최종 어느 유전자 옆에 삽입되었는지 확인하면 됩니다. 그리고 정확하게 특정 유전자 옆에 리포터를 넣는 방법보다 무작위로 실험하는 것이 실제 실험실에서 해보면 훨씬 더 시간이 절약된다는 부분도 설명해 드린 바 있네요. 또 리포터가 원래 세포에서 주변 유전자가 어느 부위에서 발현되는지를 가르쳐 주는 유전자입니다.
랜덤하게 리포터가 삽입된 여러 원숭이 중에서 어떤 특정 원숭이의 얼굴에서 리포터가 발현되고 있으면... 그 주변 유전자가 얼굴에서 발현되는 유전자라고 유추되는 겁니다. 마지막으로 insulator는 원래 생물체의 염색체에 들어 있는 겁니다. 따로 넣어주는게 아니죠. 아무튼 이론 수업 내용들을 다시 잘 정리하시기 바랍니다.