1. 미생물실험시 유의사항 및 기본조작
1.1 배지의 조제
미생물의 배양에 사용하는 배지는 비생물의 종류, 실험의 목적에 따라 여러 가지의 것이 고안되어 있으나, 기본적으로는 미생물의 생육에 필요한 탄소원, 질소원, 무기염 및 특수한 요구사항(비타민, 아미노산, 핵산염기 등등)이 배지에 첨가되지 않으면 안된다.
1.1.1 일반배지의 종류와 사용목적
A. 배지의 성분에 의한 분류
배지 중의 영양분이 복잡한 조성의 천연물이 주성분인 배지를 천연배지라고 한다. 화학조성이 명확한 약품만으로 조성된 배지를 합성배지라고 하며, 주로 화학약품으로 조성되고 소량의 천연물을 첨가한 배지를 반합성배지라고 한다.
B. 성상에 의한 분류
액체배지와 고체배지가 있다. 액체배지는 미생물의 일반적인 생육 및 물질의 생산을 목적으로 하는 실험등에 사용되며, 고체배지는 액체배지에 한천을 0.5∼2.5% 가하거나 또는 젤라틴(gelatine)을 15∼25% 가하여 굳힌 것.
C. 사용 목적에 의한 분류 명칭
일반의 배양실험에 있어서 미생물은 보전배지, 발효배지, 선택배지, 분리배지 등 그 목적에 따라 여러가지 명칭이 있다.
1.1.2 배지조제시의 주의 사항
배지의 조제는 일반적으로 다음과 같은 순서에 의해 이루어진다. ① 배지조성의 결정 ② 조합 ③ pH의 조절 ④ 분주(分注) ⑤ 살균 등이다. 그러나 ②,③ 또는 ④,⑤의 순서가 바뀌거나, 살균 후에 ③을 필요로 하는 경우가 있다.
미생물의 대사는 생리적 성질 이외에 환경의 영향을 크게 받는다. 따라서 배지성분의 약간의 차이가 배양결과에 크게 영향을 미치므로 배지의 조제에는 세심한 주의가 필요하다.
A. 기구
조제에는 유리기구, 삼각플라스크, 사까구찌 플라스크, L자형 튜브, Petri dish, 기포탑, tank, 시약스푼, 마개류 등등 청결한 것으로 사용해야 한다.
B. 배지의 재료
① 물
특별한 경우를 제외하고 소규모의 실험에서는 탈이온수를 사용한다. 목적에 따라서는 탈이온수를 다시 증류하여 사용하기도 한다. 탈이온수에는 원수의 유기물이 그대로 남게 되므로 원수의 조성에 대한 고려가 있어야 한다.
사상균은 미량원소가 적은 합성배지에서는 색소의 생성이 나빠져 균의 분류판정이 곤란한 경우가 있으므로 수도물을 사용하는 일이 있다.
② 약품
약품은 각 실험 목적에 알맞는 정도의 순품을 사용해야 한다. 보통은 일급시약을 사용하나 미량의 무기물의 섞여있을 경우 문제가 되는 배양이나 영양요구성의 확인 등의 실험에서는 특급을 사용하는 경우도 있다.
순수하지 않은 CaCO3가 함유된 배지를 auto-clave하면 pH가 변하는 일이 있으므로 축분히 고려해야 한다.
③ 천연영양물
천연영양물의 분석치는 자료에 기록되어 있으므로 알 수가 있으나 그 함량에 차이가 클 수 있음을 충분히 고려해야만 한다.
주요 천연물의 특성을 간단히 설명하면 다음과 같다.
a. 육간(meat-extract) : 동,식물의 열수추출물로서 아미조산, 펩톤, 탄수산물, 무기물 등을 많이 함유하고 있다.
b. Peptone : 동식물성 단백질의 효소분해물로서 아미노산과 펩티드(peptide)가 많이 함유되어 있다.
c. 효모추출물(yeast extract) : 효모열수추출물로서 아미노산과 비타민이 많이 함유되어 있다.
d. Casamino 산 : casein의 산가수분해물로서 tryphtophan, cystein 이하의 아미노산과 염화나트륨이 많이 함유되어 있다. 비타민과 염류를 함유하지 않은 제품도 Difco사에서 시판되고 있다.
e. CSL(corn steep liquor) : corn starch(옥수수 분말)추출잔해를 유산발효시킨 것으로 유산, 비타민, 무기질 등이 많다.
f. SVP(Soluble vegetable protein) : corn을 원료로 하는 알코올발효의 증류잔재로서 단백질, 비타민, 무기질(특히 K,P)기 많다.
g. 맥아유출물(malt-extract) : 맥아를 발효시킨 뒤 열수추출한 것으로 탄수화물이 많다.
h. 폐당밀(blackstrap molasses) : 설탕정제 후 남은 찌꺼기로 surose, glucose, fructose이외에 무기물, 비타민 등이 많다.
④ 한천
한천에 포함되어 있는 불순물에 의해 미생물의 생육이 현저하게 영향을 받는 경우가 있으므로 매우 주의해야 한다.
C. 배지의 조성
배지의 조성은 미생물의 특성을 고려하여 결정해야 한다.
D. 배지의 조합
① 배지의 조합은 일반적으로 예상한 액량의 반 이상되는 물에 배지의 성분을 차례로 녹이고 (이 때 가온 또는 stirrer를 사용하는 것이 좋다.) pH를 조절하고, 물을 가하여 만들고자 하는 액량으로 한다.
② 배지성분을 용해할 때는 될 수 있는 한 침전물이 생기는 것을 피한다. 그러기 위하여 한 성분을 완전히 녹인 후 다른 성분을 첨가하여 녹이도록 해야한다. 인산이온(PO43-), Mg2+, Ca2+, Fe2+, Mn2+ 등은 침전을 만들기 쉬우므로 별도로 용해하여 가하는 방법도 행해진다. 또 autoclave하기 전에는 침전이 일어나지 않아도 가열로 인하여 침전이 생기는 배지도 있을 수 있다. 이 때에는 배지에 구연산 등의 킬레이트제를 첨가하거나 그 성분을 별도로 auto-clave한 후 합하는 방법도 사용되고 있다.
③ 사용빈도가 높고 첨가량이 적은 성분은 50∼1000배 정도의 짙은 농도의 보전용액을 만들어 두고 사용하면 편리하다. 단, 용액상태에서는 분해되기 쉬운 것이 있으므로 냉암소에 보전하지 않으면 안된다.
④ pH의 확인과 보정은 반드시 하여야 한다.
보정에는 보통 1N∼2N NaOH나 HCl을 사용한다. 이때 특별한 경우를 제외하고는 적어도 만들고자 하는 배지량의 반 이상의 액량에서 pH를 맞추어야 한다. 이것은 완충능이 천연배지에서는 비교적 강하나, 합성배지에서는 약한 것이 있어서, 최종 액량으로 한 경우 pH의 변화가 일어나는 경우가 있기 때문이다. 당, CaCO3, 요소, 유기물을 함유하는 배지에서는 auto-clave후에 pH가 변화하는 일이 있으므로 살균 후에 pH의 재보정이 필요한 경우가 있다. 이 때는 살균한 0.1∼0.01N HCl로 pH를 보정한다.
⑤ 고체배지의 경우 분주할 때 용기의 입구 부분의 기벽을 만지든가 하면 나중에 오염의 원인이 되므로 주의해야 한다.
⑥ Auto-clave 후에 첨가하는 것 또는 별도로 첨가하지 않으면 안되는 것들을 아래와 같이 기술한다.
a. 침전물을 만들기 쉬운 것 : Ca2+, Mg2+, Fe2+, Mn2+, PO43-, SO42-
b. 가열에 의해 색을 띠게 되는 것 : 당(糖)
c. 가열에 의해 분해되기 쉬운 것 : 일부의 비타민, 요소, 항생물질, pH5.5이하인 경우의 한천
d. pH를 변하게 하기 쉬운 것 : 당, 요소, 탄산칼슘, 유기물
e. 비점(boiling point)이 낮은 것 : ethanol, methanol
1.1.3 고체 배지의 제조법
A. 일반적인 주의 사항
① 한천은 96℃에서 용융하여 한천의 종류와 농도에 따라서 43℃ 전후에서 굳는다.
그러나 실제로는 굳는 온도를 50℃ 정도로 보면 무방하다. 한천은 pH 5.5 이하의 조건에서 auto-clave하면 굳기 어려우므로 낮은 pH의 한천 배지를 만들 때에는 목적하는 pH로 조정하여 한천을 제외한 배지와 pH를 5.5∼6.0으로 조절한 한천을 별도로 살균하여 60℃ 정도로 식힌 후 양 배지를 혼합하여 굳히면 좋다. 이 방법을 이용하면 pH 3.0정도의 한천배지도 만들 수 있다.
② 중성의 pH일지라도 배지를 수 차례 반복하여 살균하면 고형화가 어렵게 된다.
③ 한천을 이용하는 미생물 또는 유기물이 존재하면 생육이 억제되는 미생물의 고체배지로는 한천 대신 실리카겔(5∼6%), gelrite(Pesudomonas속이 생산하는 hetero당의 polymer), pluronic polyol F 127등이 사용된다.
④ 젤라틴을 25℃에서 녹으며, 20℃에서 응결한다. 장시간 가열하면 굳지 않는다.
⑤ 한천배지는 급격히 냉각시키면 응집되는 물이 많아지므로 평판배지의 경우 auto-clave에 의해 살균 후 배지가 약간 식은 후에 분주하는 것이 좋다.
고체 배지는 사용 전에 건조기 또는 항온기에 넣어 응집된 물을 제거하여 표면을 말린 후 사용한다.
B. 평판배지(Plate medium)
① 삼각플라스크 또는 시험관에 한천(1.5∼2.5%)을 넣는다. 대량의 배지를 만들 때에는 주전자를 사용하면 편리하다. 또한 액량은 용기 용량의 ⅔ 또는 ¾ 이하를 넣는 것이 좋다.
② 살균은 액량이 많으면 배지의 중앙부까지 열이 전달되기 어려우므로 기압이 오르기 전의 끓이는 시간 또는 120℃에서의 압력유지시간을 액량이 적을 때보다는 길게 행한다.
③ 살균 후 급격히 압력을 떨어뜨리면 마개가 열리기 쉽다. 또한 급격히 압력을 낮추면 auto-clave내의 온도가 100℃이하가 되더라도 배지의 온도는 100℃이상인 경우도 있으므로 이러한 경우 용기를 움직일 때 배지가 갑자기 끓어 넘쳐 화상을 입게 되므로 주의한다.
④ 배지가 60∼70℃ 정도로 식은 후 용기의 하부에 두텁게 녹아 있는 한천을 흔들어서 잘 섞은 후에 clean-bentch중에서 건열살균한 petri-dish에 배지를 분주하여 굳을 때까지 방치한다.
⑤ 분주하는 배지의 양은 직경 9㎝의 petri-dish에 15∼20㎖정도이다.
C. 사면배지(Slant)
① 평판배지와 마찬가지로 배지를 만든 후, 5분 이내의 auto-clave 처리로 한천을 녹인다.
② 배지가 액체 상태일 때 분주기를 사용하여 시험관에 분주한다. 액량은 보통 크기의 시험관에서 7∼8㎝로 충분한다.
③ 면전, 실리콘 마개 등을 한 후 살균하여 배지가 녹아 있는 상태에서 아래의 그림에서 보는 바와 같이 시험관을 기울여 배지를 굳힌다.
④ CaCO3가 들어있는 배지는 살균 후 굳기 전에 믹서로 재빨리 혼합하여 기울여 굳힌다.
⑤ 모든 조작과정 중에 배지가 마개부분에 묻지 않도록 주의한다.
D. 고속배지(Stab)
배지의 양을 사면배지보다 많도록 10㎖ 전후로 하여 그림에서 보는 바와 같이 수직으로 세워서 고형화시킨다.
E. 반유동한천배지(Semi Solid Agar)
① 한천의 농도를 0.5%로 하여 C - ②, C - ④와 같은 방법에 따라서 배지를 만든다.
② 될수록 투명하게 만든다.
③ 반고형상태이기 때문에 형태가 파손되기 쉬우므로 굳은 뒤 조심하여 취급할 필요가 있다.
1.2 살균과 제균
미생물 실험에 있어서는 외부로부터 미생물이 배지 중에 유입되어서는 안된다. 그러기 위해서는 배지가 무균적인 상태이어야 하기 때문에 이를 위하여 기구.배지의 살균을 행하고, 외부로부터 잡균의 유입을 방지하기 위하여 일반적으로 용기의 입구에 실리콘 마개 등을 하여 미생물의 용기 내의 유입을 방지한다.
1.2.1 가압살균
일반적으로 배지, 생리적식염수, 기구(여과기 등)를 살균하는데 사용된다.
① 살균하는 것의 마개 등이 젖지 않도록, 유지 또는 알루미늄 호일 등을 씌운다. 여과기를 살균하는 경우는 열려있는 부분을 유산지나 알루미늄 호일 등으로 씌운다.
② Auto-clave의 뚜껑을 덮은 후 통상 15∼20분간 살균하며, 살균 후 20∼30분간 방치하여 온도가 100℃ 이하로 된 것을 확인한 후 배기구를 연다. 100℃ 이상일 때 밸브를 열면, 배지가 끓어 넘치는 일이 있으므로 주의해야 한다.
1.2.2 자외선살균
저기압수은램프를 이용하여 살균력이 가장 강한 2,600∼2,800Å의 파장을 방사시켜 살균하는 방법으로 무균조작실, 무균상, 안전 cabinet 등에 이용된다.
이 방법의 단점은 그 살균작용이 표면적이어서 내부는 살균작용이 되지 않으며, 수은램프를 직접 바라보면 눈이 상하게 되므로 쳐다보지 않도록 주의한다. 또 장기간 사용하면 살균력이 저하되므로 정기적으로 (반년에 1회정도) 새로운 램프로 교체할 필요가 있다.
1.2.3 가스살균
가스살균은 가스상태의 화학약제를 사용하여 고체 상태의 재료 등을 살균하는 방법이다.
이 방법은 열이나 수분에 약한 재료에 적용되나 가스(에틸렌옥사이드)가 가연성과 독성이 강하므로 취급할때는 특히 주의한다.
1.2.4 막여과 제균법
막여과(membrain filter)법은 최근 막의 재질의 다양성, 물성치의 향상 등에 힘입어 널리 이용하게 되었다. 이 방법은 가열할 수 없거나 막에 흡착되지 않는 것을 제균할 때 널리 사용된다.
① 여과막, filter holder, 부속품(주사관, 흡인병 등)을 목적에 따라 선택한다. 이들은 여러 종류가 있으나 통상 시료가 5∼10㎖ 이하의 경우는 주사기형을 ,그 이상의 경우에는 흡인병형을 사용한다.
② 주사기형은 그림1-2에서 보는 바와 같은 형태로서 살균의 고정을 거치지 않고 직접 주사기에 꽂아 사용할 수 았도록 제품화되어 시판되고 있어서 매우 편리하다.
③ 흡인관형은 그림 1-3에서 보는 바와 같이 filter holder가 사용된다. Holder는 상하 두 부분으로 나뉘어져서 그 사이에 스크린, 멤브레인 필터를 끼워서 사용하도록 되어 있다.
④ 여과막은 구멍의 직경, 크기, 재질을 기준하여 적당한 것을 선택한다.구멍의 직경은 14㎛로부터 0.01㎛의 것이 시판되나 무균여과의 목적으로는 보통 0.45㎛의 것이 사용된다.
1.2.5 건조살균법
150∼160℃에서 30분∼1시간 정도 가열하면 모든 미생물의 포자가 탄화하여 살균된다. 이런 목적을 위하여 사용되는 기구를 건조살균기라고 한다. 이 방법은 면전 또는 실리콘 마개를 한 시험관이나 플라스크, Petri-dish 등의 고온에 파손되지 않는 것을 살균한다.
이상을 요약하여 표에 정리하였다.
표. 살균 및 제균법
살균의 대상
살균 방법
비고
백금선, 백금이, 배양조작시의 면전
화염살균법
직접 불에 달군 후 식혀서 사용 면전은 2∼3회 불속을 통과
고열에 견디는 기구류
면전배양용기, 샤아레, 피펫
건열살균법
160∼170℃, 30분∼1시간
spore등의 살균에 유효
배지, 플라스틱주사기, 용액류, 여과기, 건조살균이 불가능한 것
고압증기살균법
Autoclave사용
→ 1 Kg/cm (120℃), 15∼30분
가열가능의 용액
무균여과법
Membrane filter
손, 무균상자, 두터운 유리
화학약품
알코올(60%), 크레졸, 오스방
무균실
자외선
파장 2,600∼2,800Å
가열가능의 고형물질
가스살균
에틸렌옥사이드(가스형 약제)
1.2.6 마개류
배양에 사용하는 시험관, 플라스크 등은 잡균이 혼입하지 않도록 미리 마개(면전, 실리콘 마개)등을 한 후 살균한다. 이들 마개는 배양 중 공기나 가스 등의 유입,유출이 자유로우면서도 공기 중의 잡균의 혼입을 막는 filter의 역할을 한다.
A. 면전
시험관에 면전을 하려면 우선 솜(탈지면은 안됨)을 펼쳐 끝부분으로부터 손으로 폭 5∼6㎝의 띠 형태로 절단하여 그것을 사각형으로 잘라서 중심부에 1∼2대의 얇은 선을 놓아서 심지를 만든 다음 주위로부터 이것을 에워싸듯이 하여 딱딱한 기둥 모양을 만들고, 시험관 입구에 밀어 넣는다. 시험관의 바깥부분에 머리 부분이 1∼2㎝정도 나오게 하고, 시험관 내에 3∼4㎝의 길이가 되도록 하면 적당하다. 삼각 플라스크나 그 외의 기구류도 이 방법에 준하여 면전을 만든다.
면전을 할 때에는 다음과 같은 주의사항이 요구된다.
① 다량의 솜을 무리하여 시험관에 밀어넣으면 시험관이 깨져 손에 상처를 입게 되는 경우가 있으므로 솜을 적당량 사용한다.
② 면전의 상태가 너무 딱딱하거나 헐겁지 않도록 유의한다. 면전을 잡고 시험관을 약하게 흔들어 시험관이 빠지지 않을 정도가 적당하다.
③ 시험관 내부의 봉입부분의 면전이 불균일하거나 주름이 잡히지 않도록 유의한다.
④ 면전을 할 때는 솜먼지를 흡인하지 않도록 마스크를 쓰도록 한다.
B. 실리콘전(마개)
지금까지는 모두 면전을 사용하였으나, 면전을 만드는 작업을 생각하면 비능률적인 작업이라고 생각된다. 이와 같은 노력을 절약하기 위하여 폴리우레탄마개가 고안되었으나 장기간의 배양이나 균주의 보전에는 부적당하므로 이것을 대신하여 실리콘마개가 고안되었다.
직경 25㎜(250㎖ 삼각플라스크용), 24㎜(대형시험관용), 17㎜(소형시험관용) 등이 있다.
모두 면전과 같은 모양으로 성형이 되어있고, 건열살균과 auto-clave살균도 할 수 있으며, 장기간의 배양이나 slant 소형시험관에도 사용할 수 있다.
또 물에 씻은 후 재사용이 가능하다. 면전이나 폴리우레탄 마개와 비교하면 공기의 유통이 약간 나쁘기 때문에 slant시험관의 벽에 물방울이 남는 일이 많으므로 주의해야 한다.
1.3 무균조작
미생물은 극히 작은 생물로서 어느 곳에서나 존재하므로 목적하는 미생물 이외의 미생물의 혼입을 피하기 위하여 세심한 주의를 해야 함은 물로 도구도 준비하지 않으면 안되는데, 균을 접종함에 있어서 접종하고자 하는 배지는 물론 그 밖의 무균상, 무균실, clean bench, safety cabinet, 백금이, 백금선, 분무기, 살균소독약품, 피펫 등이 필요하다.
1.3.1 무균접종작업에 사용되는 기구
A. 무균상, 무균실
무균상황을 만들기 위하여 실험실에서는 무균상자를 사용하는 일이 많다. 5개의 면이 유리로 된 상자로서 앞면만이 상하로 문을 열 수 있도록 만든 것이다. 내부에는 적외선 살균등을 부착하여 항상 무균상태를 유지하도록 하며 무균상을 사용하기 전에 살균액을 사용하여 내부를 살균한다.
살균액으로 역성비누액(오스방)을 분무한 후 20∼30분간 방치하여 두면 내부에 있던 잡균(특히 곰팡이의 포자) 및 먼지가 물방울과 함께 무균상자의 아래로 떨어져 내려 내부의 공기가 깨끗하여짐과 동시에 잡균은 살균된다.
무균실은 무균상자와 동일한 원리를 적용하여 방을 만든 것이라고 생각하면 된다.
B. Safety cabinet 또는 clean bench
무균상자에 비하여 매우 쉽고도 신속하게 작업환경을 무균화 하는 것이 가능하다.
실험자의 전면에 장애물이 전혀 없으므로 조작이 매우 용이한 반면, 무균상자보다 고가이다.
설비의 기본부분을 점하는 것은 무균의 제거 목적에 사용되는 high efficiency particle air(HEPA)filter이다. 이 filter의 성능으로서 이것을 통과하는 공기 중의 0.3㎛ 이상의 입자를 99.99% 이상 제거하는 능력이 요구된다.
그 개요는 그림 1-4에서 보는 바와 같다.
C. 백금이 및 백금석
균을 접종할 때 사용하는 기구로서 본래 백금선를 사용하였으나 현재는 백금선 대신에 니크롬선을 금속에포나이트제의 holder에 끼워서 사용한다. 그림 1-5에서 보는 바와 같이 여러 가지 형태의 것을 만들어 두고 사용 목적에 따라 선택, 사용하면 편리하다.
효모, 세균을 접종할 때는 백금선,
백금이 중의 어느것을 사용하여도 좋다. 천자배양의 경우에는 백금이를 이용한다. 사상균의 경우에는 백금갈고리를 사용한다. 사상균의 경우에는
기역자로 굽힌 백금갈고리를 사용하면 포자 또는 균사의 일부를 떼어내는데 편리하다.
D.
피펫류 유리나 피펫류는 앞에서 서술한
방법에 따라 살균하여 두고 사용한다. 최근에는 피펫류에 대신하여 자동피펫의 팁 부분을 쿠킹호일에 싸거나 비이커 등에 담아서 쿠킹호일로
뚜껑을 한 다음, auto-clave살균하여 사용하는 방법도 이용되고 있다. 1.3.2
접종조작 미생물 그 자체가 전혀 무해하다고
할 수 없으므로 무신경하게 취급하여 비산시키거나 하는 일이 없도록 주의해야 한다. 균체가 묻은 피펫류 등은 살균액이
들어있는 용기에 넣어 안전을 도모하는 것이 좋다. A. Lyophil의
개봉법 Lyophil(진공건조보존균주)의 상태로 보존한 균을 실험에 사용하기 위하여는 우선 개봉하여 적당한 배지에 생육시키지
않으면 안된다. lyophil관을 줄을 가지고
작은 흠집을 낸 후, 별도로 0.5∼1㎖의 복원액(배양액 또는 생리식염수)를 준비한다. lyophil관을 70% 알코올로 닦고 멸균한
솜이나 거즈로 눌러서 깨뜨린다. 또는 흠집을 낸 부분에 빨갛게 달군 유리봉의 선단면을 살짝 접촉시켜
깨뜨린다. lyophil관에 소량의
복원액을 가하여 내용물을 용해한 후 액체배지에 접종한다. 동시에 평판배지에도 잘 발라서 오염의 유무와 colony의 형상를 확인한다.
lyophil관을 깨뜨릴 때 공기가 급속히 관내부에 들어가 건조상태의 균체가 비산하거나 또는 공기 중의 잡균에 의한 오염의 우려가
있으므로 충분한 주의가 필요하다. B. Slant배양에 의한 보전
호기성균의 경우 일반적으로
한천사면배지(Slant)에 보전하는 일이 많으며 발효실험에서는 사면배양의 보존균주로부터 직접 균주를 배양하지 않고 일단 새로운
사면배지에 이식하여 생육이 활발한 상태의 균을 사용하므로 반드시 균의 계속적인 이식작업을 하지 않으면
안된다. 사상균의 이식은 포자가 비산하기
쉬우므로 특히 주의가 요구된다. C. slant에서 액체배지로의
이식 B와 같은 방법에 의하여
Slant에서 균을 백금이로 소량을 취하여 액체배지에 넣은 후 2∼3회 흔들어서 균을
접종한다. D. 액체배지에서 액체배지로의
균접종 종배지에 생육시킨 균을
발효배지에 접종하는 경우에 행해지며 이 때는 미리 건조살균한 피펫을 사용한다. 사용한 피펫은 살균액이 들어있는
용기에 집어넣는다. 1.4
배양방법 미생물을 배지에 접종하여 특정의
조건하(온도, 통기, pH, 배지조성 등등)에서 증식시키는 과정을 배양이라고 한다. 1.4.1
배양장치 A.
항온조 미생물을
일정한 온도로 유지하여 배양하는 상자로서 사면, 평판배양에
사용된다. B.
진동배양기 호기성균의 액체배양에 사용된다. ①
회전식 - 로터리shaker : 삼각플라스크 ②
왕복식 - 레시프로칼 shaker: 시험관, 사꾸라치 플라스크 ③
모노식 - mono shaker : L자형시험관 C.
기타 혐기성균이나 가스자화균의 배양에서는 밀페형이나 가스교환이 가능한 용기가 사용된다. 대량의 배양을 할 때는 기포탑,
shaker, fermanter, 배양탱크를 사용한다. 특수장치로서 온도변화진탕배양장치, 가스배양용 shaker, 연속배양탱크가
있다. 1.4.2
고체배양법 A.
사면배지(Slant culture) 사면배지에 세균, 효모의 경우는 백금이 또는 백금선으로 일직선을 긋든가 全面에 잘 바른다. 사상균의 경우는 백금갈고리를
사용하여 포자 또는 균주의 일부를 취하여 사면상에 부착시켜
배양한다. B.
평판배양(Plate culture) 평판배지에 세균, 효모를 적당히 바른다. 사상균의
경우는 샤아레를 꺼꾸로 한 후 조용히 한 점을 접종한다. 샤아레를
뒤집어 놓은 상태로 접종한다. C.
천자배양(Stab culture) 통성혐기성균(유산균 등)의 보존 및 젤라틴의 액화실험 등에 이용된다. 고체배지에 백금선을 사용하여 천자하여 접종
배양한다. 가스를
생산하는 것은 균열이 생긴다. D. 그
밖의 고체배양 쌀,
겨종류, 감자 또는 빵 등에 의한 배양 등이
있다. 1.4.3
액체 배양법 A.
정치배양법(Stasic culture) 효모,
혐기성세균, 통성혐기성세균의 배양 및 각종의 생리적 실험 등에 사용된다. 또 사상균에서는 액체배지를 사용한 표면배양의 방법도
행해진다. B.
진탕배양법(Shaking culture) 실험실에서 가장 많이 이용하는 호기성균, 통성혐기성균의 액체배양법으로서 전항의 진탕배양기를 사용한다. 통상의 사용조건은
아래의 표에서 보는 바와 같으며 회전수와 액량의 관계는 기종에 따라서 차이가
있다. 이 때
면전이 젖지 않도록 하여야 하며 마개가 젖게 되면 잡균 오염의 원인이 될 뿐 아니라 통기 효과도 떨어지게
된다. 시험관의
진탕배양은 주로 균주의 screening등 다수의 균주를 처리할 때
사용된다. 표. 진탕배양시의
배지의 적정액량 모노식진탕기는 L자형 시험관을 그대로 비색계에 걸 수도 있으므로 균의 생육실험, 변이실험 등에 많이 사용된다. 물질의 생육
등의 실험에서는 250㎖ 삼각플라스크, 판구 플라스크가 많이 사용되며 2ℓ플라스크는 실험실에서 대량의 배양액을 필요로 할 경우나 균을
대량배양할 때의 종배양에 사용된다. 이 경우
균접종용의 고무관을 부착한 플라스크를 사용한다. 1.4.4
통기교반배양법(Aeration and agitation culture) 기포탑,
jar, fermentor, 발효탱크 등에 의한 배양시에
이용된다. 1.4.5
배양시의 주의사항 미생물은
생물이므로 각 균을 특정의 조건에서 배양하지 않으면 안되며 배양시에 정성을 가지고 끊임없이 관찰하는 것이
중요하다. A. 온도와
통시의 문제는 항상 주의를 요하며 경우에 따라서는 온도에 대해서도 주의한다. B. pH와
배지의 조성 배양
도중 약제나 당, 암모니아 등의 영양분을 첨가하든가 sampling을 또는 pH를 조절해야 할 때는 무균실에서 무균적으로 하여야
한다. 진탕배양에서는 pH미터에 의한 pH의 조절이 어려운 경우가 많으므로 배양 중에 미리 지시약을 첨가하여 색의 변화에 따라
산 또는 알칼리를 첨가하든가 미리 탄산칼슘이나 완충액을 넣어두는 방법이
있다. 보통은
다음의 약제를 사용한다. pH지시약 : phenol red, cresol red, bromothymol blue등을 목적 pH에 따라 사용하며
첨가 농도는 10∼20㎎/ℓ정도이다. 알칼리액
: 0.5∼2N NaOH, 2∼10% 암모니아수, 5∼20% 탄산 암모늄수 산용액
: 0.5∼2N HCl, 황산, 인산, 초산 등이 사용 탄산칼슘
: 약 3% 완충액
: tris염산, tris malate, 인산완충액이
사용 C. 잡균의
오염 배양중에는 수시간 연속하여 배양하게 되는 경우에라도 매일 1회는 반드시 균의 생육상태를 관찰하여 잡균의 오염, 면전이
빠지지 않았는가, 면전이 젖지 않았는가 등을 조사한다. 이외에도
박테리아 파지의 혼입, 영양요구성 등의 탈락 등이 있을 수 있으므로 상황에 따라서 적절히 설치한다.
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종류
배양기기
배지용액(㎖)
회전수(rpm)
통상
최소
최고
통상
최소
최고
회전식진탕기
250㎖삼각플라스크
20∼30
10
70
220
140
250
2L
삼각플라스크
300
100
500
200
140
230
왕복식진탕기
판구
플라스크
30
15
80
120
90
150
대형시험관
10
5
20
280
280
400
소형시험관
5
3
7
280
280
400
모노식진탕기
L자형시험관
10
5
15
40
-
100