가족성 비골수 갑상선암에서 확인된 CHEK2 생식세포 변이체는 단백질 구조 및 기능 장애를 유발합니다.
오픈 액세스DOI:https://doi.org/10.1016/j.jbc.2024.105767
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갑상선 비수질암(NMTC)의 약 5-15%는 가족성 형태로 존재합니다(가족성 비골수 갑상선암[FNMTC]). FNMTC의 유전적 기반은 아직 많이 알려지지 않았으며, 이는 진단 및 임상 관리에 한계가 있음을 나타냅니다. 최근에는 갑상선암(TC) 환자에서 DNA 복구 관련 유전자의 생식세포 돌연변이가 밝혀져 FNMTC 병인에 대한 역할을 시사하고 있습니다. 여기에서 두 명의 FNMTC 가족이 연구되었으며, 각 가족은 TC의 영향을 받는 두 명의 구성원이 있습니다. 차세대 염기서열 분석을 통해 94개의 유전성 암 소인 유전자를 분석한 결과, 각 FNMTC 계열에서 TC로 분리된 2개의 생식세포 CHEK2 미센스 변이체(c.962A > C, p.E321A 및 c.470T > C, p.I157T)가 밝혀졌습니다. CHK2 단백질 키나아제 도메인에 위치한 p.E321A는 이전에 문헌에 보고되지 않은 희귀 변이체입니다. 반대로, CHK2 포크헤드 관련 도메인에 위치한 p.I157T는 병원성에 대한 상반된 해석을 가지고 광범위하게 설명되었습니다. CHK2 단백질(WT 및 변이체)은 생물물리학적 방법, 분자 역학 시뮬레이션 및 면역조직화학을 사용하여 특성화되었습니다. 전반적으로, 이러한 CHK2 변이체의 생물물리학적 특성 분석은 WT 단백질에 비해 구조적 및 구조적 안정성을 손상시키고 키나아제 활성을 손상시키는 것으로 나타났습니다. CHK2는 체외에서 아밀로이드 유사 피브릴로 응집되는 것으로 보이며, 이는 암 병태생리학에서 CHK2를 포지셔닝하기 위한 미래의 전망을 열어줍니다. CHK2 변이는 이러한 구조적 변화에 대해 더 높은 경향을 보였으며, 갑상선 종양에서도 더 높은 발현을 보였다. 본 연구 결과는 단백질 구조 및 기능에서 유전적 변이의 영향을 이해하기 위한 보완적 생물물리학 및 인실리코(in silico) 접근법의 유용성을 뒷받침하며, FNMTC 유전적 기반에서 CHEK2 변이체의 역할에 대한 현재 지식을 전향적 임상 번역과 함께 개선합니다.
키워드
약어:DLS(동적 광산란), DSF(시차 주사 형광 측정법), FFPE(포르말린 고정 파라핀 포매), FHA(포크헤드 관련), FND(여포성 결절성 질환), FNMTC(가족성 비골수 갑상선암), IHC(면역조직화학), LOH(이형접합성 손실), MD(분자 역학), NGS(차세대 염기서열 분석), NMTC(비골수 갑상선암), NOS-TN(갑상선 결절 없음), PDB(단백질 데이터 뱅크), PTC(갑상선 유두암), SEC(크기 배제 크로마토그래피), VUS(유의성이 불확실한 변이))
갑상선암(TC)은 가장 흔한 내분비 악성 종양으로, 전 세계 모든 암 진단의 ∼3%를 차지합니다(
). 가장 빠르게 증가하고 있는 암 유형으로, 남녀 비율이 1:3(
). 대부분의 갑상선 종양(약 95%)은 갑상선 여포 세포에서 유래하며 비수질 갑상선암(NMTC)으로 지정됩니다(
). 이러한 종양의 대부분은 산발적이지만, 모든 여포 세포 유래 갑상선 종양의 5-15%는 가족성 갑상선암으로 가족성 비골수 갑상선암(FNMTC)으로 지정됩니다. FNMTC 가족에서 환자는 양성 병변[예: 갑상선 여포성 결절성 질환(FND) 및 여포성 갑상선 선종]과 함께 TC를 나타내는 경우가 많으며, 갑상선 유두암(PTC)이 가장 빈번한 아형(
). FNMTC는 임상적 특성에 따라 증후군과 비증후군의 두 그룹으로 나눌 수 있습니다. 드물기는 하지만, 증후군 FNMTC의 기저에 있는 유전적 변형은 잘 정의되어 있습니다(
). 반대로, 비증후군 FNMTC의 유전적 배경과 임상적 행동과의 연관성은 현재 논란의 여지가 있으며 잘 이해되지 않고 있습니다(
). 비증후군 FNMTC는 세계보건기구(WHO) 분류에서 임상적으로 최소 3명의 1급 친척에게 여포 세포 유래 TC가 존재하거나 2명 이상의 1급 친척에 PTC가 존재하며, 이전의 방사선 또는 유전성 암 증후군(
). 최근 몇 년 동안 FNMTC의 병인을 더 잘 이해하기 위해 몇 가지 접근 방식이 수행되었습니다. 게놈 전반의 연관성 연구, 연계 분석, 표적 및 전체 엑솜/게놈 염기서열 분석을 통해 여러 염색체 유전자좌[MNG1(14q32), TCO(19p13.2), NMTC1(2q21), FTEN(8p23.1-p22), PRN(1q21), 6q22, 8q24 및 12q14](
)뿐만 아니라 DICER1, SRGAP1, NKX2-1, FOXE1, SRRM2, RTFC, HABP2, MYO1F, MAP2K5 및 최근에는 SPRY4와 같은 유전자의 위험 변이를 유발할 수 있습니다 (
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). 또한, DNA 복구 관련 유전자의 생식세포 변이체, 즉 BRCA1/2, ATM, CHEK2 및 MSH6가 최근 FNMTC 및 NMTC(
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), FNMTC 발병기전에서 이러한 유전자의 역할을 시사합니다. 이러한 발견에도 불구하고 FNMTC의 분자적 기초는 거의 알려지지 않았는데, 이는 이러한 유전자가 소수의 가족에서만 돌연변이를 일으켰기 때문입니다. 따라서 비증후군 가족의 경우 유전자 검사는 진단, 치료 및 후속 결정에 대한 지침에서 여전히 다루지 않습니다(
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).
이 연구에서는 FNMTC를 앓고 있는 포르투갈 가족 2명에서 암 소인과 관련된 94개의 유전자를 분석하기 위해 상용 패널을 사용했습니다. 이 접근법을 통해 CHEK2 유전자에서 두 가지 병원성 변이체를 식별할 수 있었습니다. CHEK2는 세린/트레오닌 단백질 키나아제 CHK2를 암호화하는 종양 억제 유전자로, DNA 이중 가닥 절단에 반응하는 DNA 손상 체크포인트의 핵심 매개체로, 게놈 무결성(
). CHEK2의 돌연변이는 산발성 암의 하위 집합에 존재할 뿐만 아니라 환자를 여러 유형의 가족성 암(
), FNMTC의 맥락에서 점점 더 많은 증거가 나타나고 있습니다(
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). 이 연구에서 확인된 CHK2 변이체는 생물물리학적 방법과 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 사용하여 구조적, 기능적으로 특성화되었습니다.
결과차세대 염기서열분석(NGS) 및 변이체 우선순위 지정
본 연구에서는 94개의 암 소인 유전자에서 생식세포 변이체에 대한 스크리닝을 두 FNMTC 계열의 probands의 DNA에서 수행했습니다[Family 24 (F24), individual II.1; Family 83 (F83), individual II.2] (그림 1), TruSight Cancer Kit를 사용한 NGS 분석 사용.
그림 1: CHEK2 변이체를 가진 두 FNMTC 제품군의 가계도. CHEK2 변이체 p.I157T 및 p.E321A는 각각 F24 및 F83 패밀리에서 확인되었습니다. F, 가족; FNMTC, 가족성 비골수 갑상선암.
NGS에 이어 생물정보학 분석을 실시하였다. 두 샘플에서 총 805개의 변이가 검출되었습니다. 따라서, 잠재적인 병원성 변이체를 선택하기 위해 특정 기준과 필터를 적용하여, F24에서 검출된 c.470T > C, p.I157T(엑손 4) 및 F83에서 c.962A > C, p.E321A(엑손 9)와 같은 두 개의 생식세포 체크포인트 키나아제 2(CHEK2)(NM_007194.4) 미센스 변이체를 드러냈습니다(NGS 데이터 생물정보학 분석은 지원 정보에 자세히 설명되어 있음). 두 변이체 모두 Sanger 염기서열분석으로 확인되었습니다. F83 가족에서의 분리 분석은 CHEK2 변이가 TC, 갑상선 FND 및 가족 내 달리 특정된 갑상선 결절(NOS-TN)과 분리되지 않았음을 보여주었습니다. 변이체는 프로밴드(proband)의 이형접합성(heterozygosity)에서 검출되었다(II.2; PTC), 두 자매[PTC(II.4)와 NOS-TN(II.5)]과 아들(III.1 및 III.2; FND 및 NOS-TN입니다. FND와 난소암을 보인 proband의 어머니(I.2)는 이미 사망했기 때문에 변이의 존재를 조사할 수 없었습니다. F24 계열에서 CHEK2 변이체 p.I157T는 TC로 분리되었지만 양성/NOS 갑상선 병변과는 분리되지 않았습니다. 이 변이체는 PTC를 가진 프로밴드(II.1)와 그의 여동생(II.6)의 이형접합성에서 발견되었지만, FND(II.8)와 NOS-TN(II.4)을 가진 형제자매에서는 발견되지 않았습니다. 가족의 규모가 작기 때문에 더 이상의 분리 분석은 불가능했다. 두 CHEK2 변이 모두 100명의 포르투갈 건강한 대조군에서 발견되지 않았다.
이형접합성 소실(LOH)은 암 발생에서 흔한 유전적 사건이며 많은 유전성 암 증후군에서 종양 억제 유전자의 WT 대립유전자의 체세포 불활성화에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 두 번째 히트를 조사하기 위해, CHEK2 변이 보유자로부터 이용 가능한 양성 및 악성 갑상선 병변에서 CHEK2와 관련된 LOH의 존재를 평가하였다(F24: II.1 및 II.6; F83: II.2 및 II.4). 그러나 생식세포 변이체가 환자의 종양에서 이형접합성에서 발견되었기 때문에 LOH를 암시하는 패턴은 검출되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한, F83 계열의 환자 II.4의 갑상선암(PTC)에 대한 NGS 분석에서는 체세포 CHEK2 변이가 없는 것으로 나타났다. 이는 이러한 경우 다른 기전이 종양 발생의 기저에 있을 수 있음을 나타냅니다(예: 하플로인기능부전(haploinsufficiency) 또는 우성-부정적 효과(dominant-negative effect)로 이어질 수 있는 기능 상실).
CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변형체의 인실리코(In silico) 특성 분석
정상 갑상선 조직의 단백질 및 mRNA 수준에서 CHEK2 유전자의 발현은 Human Protein Atlas 데이터베이스(표 1)에서 "medium"으로 정의됩니다. 이 연구에서 확인된 CHEK2 후보 변이체의 잠재적인 기능적 결과를 추가로 조사하여 MetaLR, Mutation Assessor 및 REVEL을 인실리코 예측 도구(SIFT, PolyPhen, MutationTaster)의 공통 세트에 추가했습니다. 단백질 기능에 대한 치환의 효과에 대한 예측은 두 가지 CHEK2 변이체에 대해 낮은 효과에서 해로운 것까지 다양했습니다(표 1). 변이체는 관련 CHK2 영역에 위치합니다: I157T 치환은 포크헤드 연관(FHA) 기능 도메인에 위치하고, E321A는 대부분의 병원성 CHEK2 변이체가 위치하는 키나아제 도메인(돌연변이 핫스팟)(
) (그림 S1A). 두 변이 모두 인구 데이터베이스에 존재하지만, p.E321A(rs374395284)는 극히 드문 반면(표 1), p.I157T(rs17879961)는 유럽 인구의 0.4%에서 보고되는 더 높은 경미한 대립유전자 빈도를 가지고 있습니다. CHK2의 비교 서열 분석은 아미노산 E321이 선택된 종들 사이에서 매우 보존되어 있는 반면(그림 S1B), I157 위치는 포유류에서는 보존되지만 더 먼 친척 유기체(예: Danio rerio)에서는 보존되지 않는 것으로 나타났으며, 이는 이 아미노산의 변화가 덜 관련성이 높은 생물학적 역할을 가질 수 있음을 시사할 수 있습니다. CHK2의 위치 157 및 321 및 그 주변에서 아미노산 치환의 내성은 SNAP2(
) 히트 맵으로 표시됩니다. 소수성에서 극성으로의 전하를 띠지 않은 변화인 이소류신에서 트레오닌으로의 치환(I157T)은 중성 효과를 가질 것으로 예측됩니다(점수 −23; 그림 S1C), 글루탐산에서 알라닌(E321A), 큰 산성 잔류물에서 작은 소수성 잔류물로의 변화는 네이티브 단백질 기능을 변화시킬 것으로 예측됩니다(점수 +56; 그림 S1C). p.E321A 및 p.I157T 변이체는 모두 ClinVar 데이터베이스에 기술되어 있으며, 각각 불확실한 유의성의 변이체(VUS)(ClinVar ID: 232111)와 병원성 해석이 상충되는 변이체(ClinVar ID: 5591)로 분류되는 반면, 데이터 집계자 VarSome은 p.E321A에 동일한 분류를 할당하고 p.I157T를 병원성 가능성이 있는 변이체로 분류했습니다(표 1). p.I157T 변이체는 유방암, 결장암, 전립선암, 위암, 신장암 및 TC를 포함한 다양한 유형의 암에서 문헌에 광범위하게 기술되어 있습니다(
). 그러나 이러한 결과에 대한 해석은 모집단(
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), 또한, 가족 내 질병과의 변이 공동 분리는 가변적입니다(
), 이전 기능 연구 통찰력은 합의되지 않았습니다(
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). 한편, p.E321A 변이체는 데이터베이스(ClinVar ID: 232111)에서 유전성 유방암의 맥락에서 이미 기술되었음에도 불구하고 문헌에 발표되지 않았습니다(표 1). 전체적으로, p.E321A와 비교했을 때, p.I157T 변이체는 개체군에서 더 빈번하고, 진화 과정에서 덜 보존되며, 이미 병원성에 대한 가변적이고 모순된 설명을 가지고 있다.
표 1: F24 및 F83 제품군에서 NGS에 의해 식별된 두 가지 후보 CHEK2 변이체의인실리코(in silico) 특성 분석
가족유전자(RefSeq Transcript)염색체 위치(GRCh38)뉴클레오티드(CDS)아미노산(단백질)dbSNP 아이디MAF (%)단백질 기능의 변이 효과에 대한 인실리코(In silico) 예측데이터베이스의 주석정상 갑상선에서의 발현ACMG 분류최종bGnomAD/ALFA(NFE/유럽)구별폴리펜돌연변이 맛보기(Mutation Taster)메타LR돌연변이 평가자푹 빠 졌클린바(ClinVar)바솜mRNA/단백질a
F24 키 | CHEK2 (NM_007194.4) | 22: 28725099 | c.470T>씨 | p.I157T | rs17879961 (영문) | 0.2/0.4 | 불확 실한 | 해로운 | 해로운 | 해로운 | 낮다 | 불확 실한 | ClinVar ID: 5591 병원성/위험 인자에 대한 상충되는 해석: 병원성(5); 병원성 가능성이 있음(13); 병원성, 낮은 침투율(1); 확립된 위험 대립유전자(1); 불확실한 유의성(9) | 병원성 가능성 | 미디엄/미디엄 | 병원성 가능성 |
F83 키 | CHEK2 (NM_007194.4) | 22: 28699884 | c.962A>씨 | p.E321A | rs374395284 (영문) | 0.0007/0 | 불확 실한 | 해로운 | 해로운 | 양성 | 보통 | 불확 실한 | 클린 바 ID : 232111 불확실한 유의성(9) | 불확실한 중요성 | 미디엄/미디엄 | 병원성 가능성 |
약어: ACMG, American College of Medical Genetics and Genomics; CDS, 코딩 DNA 서열; MAF, 작은 대립 유전자 빈도; NFE, 논 피니시 유럽.
유전자, 전사체 및 염색체 위치는 Ensembl build 38에서 가져왔습니다.
a 「인간 단백질 지도」(The Human Protein Atlas) 데이터베이스.
b 본 연구에서 얻은 결과에 의해 뒷받침되는 최종 ACMG 분류.
이 연구에서는 TC 발달에서 두 가지 미센스 CHEK2 변이체의 역할을 더욱 명확히 하고 실리코, 데이터베이스 및 문헌 데이터에서 이미 사용할 수 있는 것 이상으로 현재 지식을 확장하기 위해 인코딩된 단백질의 기능적 및 구조적 특성 분석을 위해 생물물리학 및 MD 접근 방식을 사용했습니다.
재조합 절단 CHK2 단백질 생산
모든 재조합 절단된 CHK2 단백질((
); 도 1에 나타낸 S1A)는 배양액 리터당 1.2 내지 26mg의 정제된 단량체 단백질의 수율 범위로 성공적으로 정제되었다. CHK2 p.E321A 변이체는 정제 공정 중에 침전되는 경향이 더 높았으며, 예상되는 기능적 올리고머 형태에 비해 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에서 상당한 양의 올리고머 형태 또는 용해성 응집체를 생성했습니다(데이터 표시 안 됨). 분석적 SEC에 의해 모니터링된 올리고머 프로파일은 모든 단백질에 대해 유사했으며, 절단된 단량체에 대한 예상 분자량보다 ∼30% 높은 65kDa-단백질에 해당하는 하나의 주요 피크(WT CHK2에 대한 그림 S2 참조)를 나타냈습니다. 추가 분석은 이 올리고머 형태만을 사용하여 수행되었습니다.
CHK2 키나아제 활성에 대한 변이체의 효과
ADP-Glo Kinase 분석은 CDC25에서 유래한 펩타이드를 클라이언트 인산화 타겟으로 사용하여 키나아제 반응 중에 생성된 ADP의 양을 정량화하여 CHK2 단백질(WT, p.E321A 및 p.I157T) 키나아제 활성을 측정하기 위해 수행되었습니다. 동일한 효소 및 펩타이드 기질 농도를 사용하되 ATP 농도를 변화시킨 결과, ATP 농도에 관계없이 WT 단백질이 두 변이체와 비교할 때 더 높은 효소 활성을 나타내는 것을 관찰했습니다(그림 S3). 포화 ATP에서 CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변이체는 WT CHK2 효소 활성의 40-50%를 나타냈습니다(그림 2).
그림 2CHK2 ATPase 활동. CHK2 WT, p.E321A 및 p.I157T의 효소 활성은 상대 광 단위(RLU)로 측정되었습니다. 포화 ATP에서 CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변이체는 WT CHK2 효소 활성의 40-50%를 나타냈다. 두 개의 독립적인 분석이 세 번에 걸쳐 수행되었습니다. 오차 막대는 평균± SD를 나타냅니다.
CHK2 변이체가 단백질 구조 및 안정성에 미치는 영향
CHK2 WT, p.I157T 및 p.E321A는 유사한 원자외선 원형 이색법(CD) 스펙트럼(그림 3, A–C)을 나타내었으며, 이는 2차 구조 요소의 함량에 큰 변화가 없음을 나타냅니다. ∼210nm를 중심으로 한 국소 최솟값과 더 높은 λ에서 더 넓은 대역을 나타내는 얻어진 스펙트럼은 β 시트의 기여를 받는 주로 α나선형 구조를 나타냈으며, 이는 잘린 CHK2(
). 단백질 안정성에 대한 치환의 효과를 평가하기 위해 222nm에서 CD를 모니터링하여 열 변성 프로파일을 얻었습니다(그림 3D). 222nm 신호에서 CD가 더 음의 값으로 감소하는 것이 관찰되었는데, 이는 α-나선의 열 풀림에 대해 예상했던 것과는 다릅니다. 90°C에서 완전히 변성된 CHK2의 스펙트럼을 취함으로써 네이티브 CHK2의 주로 α나선형 스펙트럼이 218nm를 중심으로 하는 광대역으로 변환되는 것을 관찰할 수 있었으며(그림 3, A–C), 이는 불용성 세포독성 단백질 응집체인 아밀로이드 피브릴에서 발생하는 것과 같은 평행 β 시트를 나타냅니다. 변성된 단백질을 다시 20°C로 냉각했을 때, 스펙트럼은 90°C 스펙트럼과 거의 동일하게 유지되어 비가역적인 열 풀림을 나타냅니다(그림 3, A–C). 최종 열변성 구조에 관계없이, 용융 곡선(단순화를 위해 오름차순 곡선으로 표시됨)은 단상 시그모이드 곡선이 장착된 모든 단백질에 대해 단일 전이를 생성했습니다(그림 3D). 해당 Tm 값은 표 2에 제시되어 있으며, WT 단백질은 약간 더 높은 T를 나타냅니다m 값(+1.1 to 1.7 °C)을 두 가지 변형과 비교할 때. 열 변성에 대한 내성은 시차 주사 형광 측정법(DSF)(간접 방법)으로도 평가되었습니다. 연구된 3개의 단백질의 열 변성 프로파일은 CD 열 변성 곡선(그림 3E)과 일치하고 용융 구형 또는 잘못 접힌 단백질에서 유래한 용매 노출 소수성 패치에 대한 증거가 없는 단일 명백한 전이를 나타냈습니다. 그러나, DSF에 의해, WT CHK2 및 두 변이체는 유사한 T를 나타내었다m 값(표 2).
연구 논문 | 제300권, 3호, 105767, 3월 2024
가족성 비골수 갑상선암에서 확인된 CHEK2 생식세포 변이체는 단백질 구조 및 기능 장애를 유발합니다.
오픈 액세스DOI:https://doi.org/10.1016/j.jbc.2024.105767
이전 기사LncRNA CHROMR/miR-27b-3p/MET 축은 ...
다음 기사메티오닌 설폭사이드 환원효소 2는 Cvt 자가포식을 조절합니다.
갑상선 비수질암(NMTC)의 약 5-15%는 가족성 형태로 존재합니다(가족성 비골수 갑상선암[FNMTC]). FNMTC의 유전적 기반은 아직 많이 알려지지 않았으며, 이는 진단 및 임상 관리에 한계가 있음을 나타냅니다. 최근에는 갑상선암(TC) 환자에서 DNA 복구 관련 유전자의 생식세포 돌연변이가 밝혀져 FNMTC 병인에 대한 역할을 시사하고 있습니다. 여기에서 두 명의 FNMTC 가족이 연구되었으며, 각 가족은 TC의 영향을 받는 두 명의 구성원이 있습니다. 차세대 염기서열 분석을 통해 94개의 유전성 암 소인 유전자를 분석한 결과, 각 FNMTC 계열에서 TC로 분리된 2개의 생식세포 CHEK2 미센스 변이체(c.962A > C, p.E321A 및 c.470T > C, p.I157T)가 밝혀졌습니다. CHK2 단백질 키나아제 도메인에 위치한 p.E321A는 이전에 문헌에 보고되지 않은 희귀 변이체입니다. 반대로, CHK2 포크헤드 관련 도메인에 위치한 p.I157T는 병원성에 대한 상반된 해석을 가지고 광범위하게 설명되었습니다. CHK2 단백질(WT 및 변이체)은 생물물리학적 방법, 분자 역학 시뮬레이션 및 면역조직화학을 사용하여 특성화되었습니다. 전반적으로, 이러한 CHK2 변이체의 생물물리학적 특성 분석은 WT 단백질에 비해 구조적 및 구조적 안정성을 손상시키고 키나아제 활성을 손상시키는 것으로 나타났습니다. CHK2는 체외에서 아밀로이드 유사 피브릴로 응집되는 것으로 보이며, 이는 암 병태생리학에서 CHK2를 포지셔닝하기 위한 미래의 전망을 열어줍니다. CHK2 변이는 이러한 구조적 변화에 대해 더 높은 경향을 보였으며, 갑상선 종양에서도 더 높은 발현을 보였다. 본 연구 결과는 단백질 구조 및 기능에서 유전적 변이의 영향을 이해하기 위한 보완적 생물물리학 및 인실리코(in silico) 접근법의 유용성을 뒷받침하며, FNMTC 유전적 기반에서 CHEK2 변이체의 역할에 대한 현재 지식을 전향적 임상 번역과 함께 개선합니다.
키워드
약어:DLS(동적 광산란), DSF(시차 주사 형광 측정법), FFPE(포르말린 고정 파라핀 포매), FHA(포크헤드 관련), FND(여포성 결절성 질환), FNMTC(가족성 비골수 갑상선암), IHC(면역조직화학), LOH(이형접합성 손실), MD(분자 역학), NGS(차세대 염기서열 분석), NMTC(비골수 갑상선암), NOS-TN(갑상선 결절 없음), PDB(단백질 데이터 뱅크), PTC(갑상선 유두암), SEC(크기 배제 크로마토그래피), VUS(유의성이 불확실한 변이))
갑상선암(TC)은 가장 흔한 내분비 악성 종양으로, 전 세계 모든 암 진단의 ∼3%를 차지합니다(
). 가장 빠르게 증가하고 있는 암 유형으로, 남녀 비율이 1:3(
). 대부분의 갑상선 종양(약 95%)은 갑상선 여포 세포에서 유래하며 비수질 갑상선암(NMTC)으로 지정됩니다(
). 이러한 종양의 대부분은 산발적이지만, 모든 여포 세포 유래 갑상선 종양의 5-15%는 가족성 갑상선암으로 가족성 비골수 갑상선암(FNMTC)으로 지정됩니다. FNMTC 가족에서 환자는 양성 병변[예: 갑상선 여포성 결절성 질환(FND) 및 여포성 갑상선 선종]과 함께 TC를 나타내는 경우가 많으며, 갑상선 유두암(PTC)이 가장 빈번한 아형(
). FNMTC는 임상적 특성에 따라 증후군과 비증후군의 두 그룹으로 나눌 수 있습니다. 드물기는 하지만, 증후군 FNMTC의 기저에 있는 유전적 변형은 잘 정의되어 있습니다(
). 반대로, 비증후군 FNMTC의 유전적 배경과 임상적 행동과의 연관성은 현재 논란의 여지가 있으며 잘 이해되지 않고 있습니다(
). 비증후군 FNMTC는 세계보건기구(WHO) 분류에서 임상적으로 최소 3명의 1급 친척에게 여포 세포 유래 TC가 존재하거나 2명 이상의 1급 친척에 PTC가 존재하며, 이전의 방사선 또는 유전성 암 증후군(
). 최근 몇 년 동안 FNMTC의 병인을 더 잘 이해하기 위해 몇 가지 접근 방식이 수행되었습니다. 게놈 전반의 연관성 연구, 연계 분석, 표적 및 전체 엑솜/게놈 염기서열 분석을 통해 여러 염색체 유전자좌[MNG1(14q32), TCO(19p13.2), NMTC1(2q21), FTEN(8p23.1-p22), PRN(1q21), 6q22, 8q24 및 12q14](
)뿐만 아니라 DICER1, SRGAP1, NKX2-1, FOXE1, SRRM2, RTFC, HABP2, MYO1F, MAP2K5 및 최근에는 SPRY4와 같은 유전자의 위험 변이를 유발할 수 있습니다 (
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). 또한, DNA 복구 관련 유전자의 생식세포 변이체, 즉 BRCA1/2, ATM, CHEK2 및 MSH6가 최근 FNMTC 및 NMTC(
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,
,
,
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), FNMTC 발병기전에서 이러한 유전자의 역할을 시사합니다. 이러한 발견에도 불구하고 FNMTC의 분자적 기초는 거의 알려지지 않았는데, 이는 이러한 유전자가 소수의 가족에서만 돌연변이를 일으켰기 때문입니다. 따라서 비증후군 가족의 경우 유전자 검사는 진단, 치료 및 후속 결정에 대한 지침에서 여전히 다루지 않습니다(
,
).
이 연구에서는 FNMTC를 앓고 있는 포르투갈 가족 2명에서 암 소인과 관련된 94개의 유전자를 분석하기 위해 상용 패널을 사용했습니다. 이 접근법을 통해 CHEK2 유전자에서 두 가지 병원성 변이체를 식별할 수 있었습니다. CHEK2는 세린/트레오닌 단백질 키나아제 CHK2를 암호화하는 종양 억제 유전자로, DNA 이중 가닥 절단에 반응하는 DNA 손상 체크포인트의 핵심 매개체로, 게놈 무결성(
). CHEK2의 돌연변이는 산발성 암의 하위 집합에 존재할 뿐만 아니라 환자를 여러 유형의 가족성 암(
), FNMTC의 맥락에서 점점 더 많은 증거가 나타나고 있습니다(
,
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,
,
). 이 연구에서 확인된 CHK2 변이체는 생물물리학적 방법과 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 사용하여 구조적, 기능적으로 특성화되었습니다.
결과차세대 염기서열분석(NGS) 및 변이체 우선순위 지정
본 연구에서는 94개의 암 소인 유전자에서 생식세포 변이체에 대한 스크리닝을 두 FNMTC 계열의 probands의 DNA에서 수행했습니다[Family 24 (F24), individual II.1; Family 83 (F83), individual II.2] (그림 1), TruSight Cancer Kit를 사용한 NGS 분석 사용.
그림 1: CHEK2 변이체를 가진 두 FNMTC 제품군의 가계도. CHEK2 변이체 p.I157T 및 p.E321A는 각각 F24 및 F83 패밀리에서 확인되었습니다. F, 가족; FNMTC, 가족성 비골수 갑상선암.
NGS에 이어 생물정보학 분석을 실시하였다. 두 샘플에서 총 805개의 변이가 검출되었습니다. 따라서, 잠재적인 병원성 변이체를 선택하기 위해 특정 기준과 필터를 적용하여, F24에서 검출된 c.470T > C, p.I157T(엑손 4) 및 F83에서 c.962A > C, p.E321A(엑손 9)와 같은 두 개의 생식세포 체크포인트 키나아제 2(CHEK2)(NM_007194.4) 미센스 변이체를 드러냈습니다(NGS 데이터 생물정보학 분석은 지원 정보에 자세히 설명되어 있음). 두 변이체 모두 Sanger 염기서열분석으로 확인되었습니다. F83 가족에서의 분리 분석은 CHEK2 변이가 TC, 갑상선 FND 및 가족 내 달리 특정된 갑상선 결절(NOS-TN)과 분리되지 않았음을 보여주었습니다. 변이체는 프로밴드(proband)의 이형접합성(heterozygosity)에서 검출되었다(II.2; PTC), 두 자매[PTC(II.4)와 NOS-TN(II.5)]과 아들(III.1 및 III.2; FND 및 NOS-TN입니다. FND와 난소암을 보인 proband의 어머니(I.2)는 이미 사망했기 때문에 변이의 존재를 조사할 수 없었습니다. F24 계열에서 CHEK2 변이체 p.I157T는 TC로 분리되었지만 양성/NOS 갑상선 병변과는 분리되지 않았습니다. 이 변이체는 PTC를 가진 프로밴드(II.1)와 그의 여동생(II.6)의 이형접합성에서 발견되었지만, FND(II.8)와 NOS-TN(II.4)을 가진 형제자매에서는 발견되지 않았습니다. 가족의 규모가 작기 때문에 더 이상의 분리 분석은 불가능했다. 두 CHEK2 변이 모두 100명의 포르투갈 건강한 대조군에서 발견되지 않았다.
이형접합성 소실(LOH)은 암 발생에서 흔한 유전적 사건이며 많은 유전성 암 증후군에서 종양 억제 유전자의 WT 대립유전자의 체세포 불활성화에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 두 번째 히트를 조사하기 위해, CHEK2 변이 보유자로부터 이용 가능한 양성 및 악성 갑상선 병변에서 CHEK2와 관련된 LOH의 존재를 평가하였다(F24: II.1 및 II.6; F83: II.2 및 II.4). 그러나 생식세포 변이체가 환자의 종양에서 이형접합성에서 발견되었기 때문에 LOH를 암시하는 패턴은 검출되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한, F83 계열의 환자 II.4의 갑상선암(PTC)에 대한 NGS 분석에서는 체세포 CHEK2 변이가 없는 것으로 나타났다. 이는 이러한 경우 다른 기전이 종양 발생의 기저에 있을 수 있음을 나타냅니다(예: 하플로인기능부전(haploinsufficiency) 또는 우성-부정적 효과(dominant-negative effect)로 이어질 수 있는 기능 상실).
CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변형체의 인실리코(In silico) 특성 분석
정상 갑상선 조직의 단백질 및 mRNA 수준에서 CHEK2 유전자의 발현은 Human Protein Atlas 데이터베이스(표 1)에서 "medium"으로 정의됩니다. 이 연구에서 확인된 CHEK2 후보 변이체의 잠재적인 기능적 결과를 추가로 조사하여 MetaLR, Mutation Assessor 및 REVEL을 인실리코 예측 도구(SIFT, PolyPhen, MutationTaster)의 공통 세트에 추가했습니다. 단백질 기능에 대한 치환의 효과에 대한 예측은 두 가지 CHEK2 변이체에 대해 낮은 효과에서 해로운 것까지 다양했습니다(표 1). 변이체는 관련 CHK2 영역에 위치합니다: I157T 치환은 포크헤드 연관(FHA) 기능 도메인에 위치하고, E321A는 대부분의 병원성 CHEK2 변이체가 위치하는 키나아제 도메인(돌연변이 핫스팟)(
) (그림 S1A). 두 변이 모두 인구 데이터베이스에 존재하지만, p.E321A(rs374395284)는 극히 드문 반면(표 1), p.I157T(rs17879961)는 유럽 인구의 0.4%에서 보고되는 더 높은 경미한 대립유전자 빈도를 가지고 있습니다. CHK2의 비교 서열 분석은 아미노산 E321이 선택된 종들 사이에서 매우 보존되어 있는 반면(그림 S1B), I157 위치는 포유류에서는 보존되지만 더 먼 친척 유기체(예: Danio rerio)에서는 보존되지 않는 것으로 나타났으며, 이는 이 아미노산의 변화가 덜 관련성이 높은 생물학적 역할을 가질 수 있음을 시사할 수 있습니다. CHK2의 위치 157 및 321 및 그 주변에서 아미노산 치환의 내성은 SNAP2(
) 히트 맵으로 표시됩니다. 소수성에서 극성으로의 전하를 띠지 않은 변화인 이소류신에서 트레오닌으로의 치환(I157T)은 중성 효과를 가질 것으로 예측됩니다(점수 −23; 그림 S1C), 글루탐산에서 알라닌(E321A), 큰 산성 잔류물에서 작은 소수성 잔류물로의 변화는 네이티브 단백질 기능을 변화시킬 것으로 예측됩니다(점수 +56; 그림 S1C). p.E321A 및 p.I157T 변이체는 모두 ClinVar 데이터베이스에 기술되어 있으며, 각각 불확실한 유의성의 변이체(VUS)(ClinVar ID: 232111)와 병원성 해석이 상충되는 변이체(ClinVar ID: 5591)로 분류되는 반면, 데이터 집계자 VarSome은 p.E321A에 동일한 분류를 할당하고 p.I157T를 병원성 가능성이 있는 변이체로 분류했습니다(표 1). p.I157T 변이체는 유방암, 결장암, 전립선암, 위암, 신장암 및 TC를 포함한 다양한 유형의 암에서 문헌에 광범위하게 기술되어 있습니다(
). 그러나 이러한 결과에 대한 해석은 모집단(
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), 또한, 가족 내 질병과의 변이 공동 분리는 가변적입니다(
), 이전 기능 연구 통찰력은 합의되지 않았습니다(
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). 한편, p.E321A 변이체는 데이터베이스(ClinVar ID: 232111)에서 유전성 유방암의 맥락에서 이미 기술되었음에도 불구하고 문헌에 발표되지 않았습니다(표 1). 전체적으로, p.E321A와 비교했을 때, p.I157T 변이체는 개체군에서 더 빈번하고, 진화 과정에서 덜 보존되며, 이미 병원성에 대한 가변적이고 모순된 설명을 가지고 있다.
표 1: F24 및 F83 제품군에서 NGS에 의해 식별된 두 가지 후보 CHEK2 변이체의인실리코(in silico) 특성 분석
가족유전자(RefSeq Transcript)염색체 위치(GRCh38)뉴클레오티드(CDS)아미노산(단백질)dbSNP 아이디MAF (%)단백질 기능의 변이 효과에 대한 인실리코(In silico) 예측데이터베이스의 주석정상 갑상선에서의 발현ACMG 분류최종bGnomAD/ALFA(NFE/유럽)구별폴리펜돌연변이 맛보기(Mutation Taster)메타LR돌연변이 평가자푹 빠 졌클린바(ClinVar)바솜mRNA/단백질a
F24 키 | CHEK2 (NM_007194.4) | 22: 28725099 | c.470T>씨 | p.I157T | rs17879961 (영문) | 0.2/0.4 | 불확 실한 | 해로운 | 해로운 | 해로운 | 낮다 | 불확 실한 | ClinVar ID: 5591 병원성/위험 인자에 대한 상충되는 해석: 병원성(5); 병원성 가능성이 있음(13); 병원성, 낮은 침투율(1); 확립된 위험 대립유전자(1); 불확실한 유의성(9) | 병원성 가능성 | 미디엄/미디엄 | 병원성 가능성 |
F83 키 | CHEK2 (NM_007194.4) | 22: 28699884 | c.962A>씨 | p.E321A | rs374395284 (영문) | 0.0007/0 | 불확 실한 | 해로운 | 해로운 | 양성 | 보통 | 불확 실한 | 클린 바 ID : 232111 불확실한 유의성(9) | 불확실한 중요성 | 미디엄/미디엄 | 병원성 가능성 |
약어: ACMG, American College of Medical Genetics and Genomics; CDS, 코딩 DNA 서열; MAF, 작은 대립 유전자 빈도; NFE, 논 피니시 유럽.
유전자, 전사체 및 염색체 위치는 Ensembl build 38에서 가져왔습니다.
a 「인간 단백질 지도」(The Human Protein Atlas) 데이터베이스.
b 본 연구에서 얻은 결과에 의해 뒷받침되는 최종 ACMG 분류.
이 연구에서는 TC 발달에서 두 가지 미센스 CHEK2 변이체의 역할을 더욱 명확히 하고 실리코, 데이터베이스 및 문헌 데이터에서 이미 사용할 수 있는 것 이상으로 현재 지식을 확장하기 위해 인코딩된 단백질의 기능적 및 구조적 특성 분석을 위해 생물물리학 및 MD 접근 방식을 사용했습니다.
재조합 절단 CHK2 단백질 생산
모든 재조합 절단된 CHK2 단백질((
); 도 1에 나타낸 S1A)는 배양액 리터당 1.2 내지 26mg의 정제된 단량체 단백질의 수율 범위로 성공적으로 정제되었다. CHK2 p.E321A 변이체는 정제 공정 중에 침전되는 경향이 더 높았으며, 예상되는 기능적 올리고머 형태에 비해 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에서 상당한 양의 올리고머 형태 또는 용해성 응집체를 생성했습니다(데이터 표시 안 됨). 분석적 SEC에 의해 모니터링된 올리고머 프로파일은 모든 단백질에 대해 유사했으며, 절단된 단량체에 대한 예상 분자량보다 ∼30% 높은 65kDa-단백질에 해당하는 하나의 주요 피크(WT CHK2에 대한 그림 S2 참조)를 나타냈습니다. 추가 분석은 이 올리고머 형태만을 사용하여 수행되었습니다.
CHK2 키나아제 활성에 대한 변이체의 효과
ADP-Glo Kinase 분석은 CDC25에서 유래한 펩타이드를 클라이언트 인산화 타겟으로 사용하여 키나아제 반응 중에 생성된 ADP의 양을 정량화하여 CHK2 단백질(WT, p.E321A 및 p.I157T) 키나아제 활성을 측정하기 위해 수행되었습니다. 동일한 효소 및 펩타이드 기질 농도를 사용하되 ATP 농도를 변화시킨 결과, ATP 농도에 관계없이 WT 단백질이 두 변이체와 비교할 때 더 높은 효소 활성을 나타내는 것을 관찰했습니다(그림 S3). 포화 ATP에서 CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변이체는 WT CHK2 효소 활성의 40-50%를 나타냈습니다(그림 2).
그림 2CHK2 ATPase 활동. CHK2 WT, p.E321A 및 p.I157T의 효소 활성은 상대 광 단위(RLU)로 측정되었습니다. 포화 ATP에서 CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변이체는 WT CHK2 효소 활성의 40-50%를 나타냈다. 두 개의 독립적인 분석이 세 번에 걸쳐 수행되었습니다. 오차 막대는 평균± SD를 나타냅니다.
CHK2 변이체가 단백질 구조 및 안정성에 미치는 영향
CHK2 WT, p.I157T 및 p.E321A는 유사한 원자외선 원형 이색법(CD) 스펙트럼(그림 3, A–C)을 나타내었으며, 이는 2차 구조 요소의 함량에 큰 변화가 없음을 나타냅니다. ∼210nm를 중심으로 한 국소 최솟값과 더 높은 λ에서 더 넓은 대역을 나타내는 얻어진 스펙트럼은 β 시트의 기여를 받는 주로 α나선형 구조를 나타냈으며, 이는 잘린 CHK2(
). 단백질 안정성에 대한 치환의 효과를 평가하기 위해 222nm에서 CD를 모니터링하여 열 변성 프로파일을 얻었습니다(그림 3D). 222nm 신호에서 CD가 더 음의 값으로 감소하는 것이 관찰되었는데, 이는 α-나선의 열 풀림에 대해 예상했던 것과는 다릅니다. 90°C에서 완전히 변성된 CHK2의 스펙트럼을 취함으로써 네이티브 CHK2의 주로 α나선형 스펙트럼이 218nm를 중심으로 하는 광대역으로 변환되는 것을 관찰할 수 있었으며(그림 3, A–C), 이는 불용성 세포독성 단백질 응집체인 아밀로이드 피브릴에서 발생하는 것과 같은 평행 β 시트를 나타냅니다. 변성된 단백질을 다시 20°C로 냉각했을 때, 스펙트럼은 90°C 스펙트럼과 거의 동일하게 유지되어 비가역적인 열 풀림을 나타냅니다(그림 3, A–C). 최종 열변성 구조에 관계없이, 용융 곡선(단순화를 위해 오름차순 곡선으로 표시됨)은 단상 시그모이드 곡선이 장착된 모든 단백질에 대해 단일 전이를 생성했습니다(그림 3D). 해당 Tm 값은 표 2에 제시되어 있으며, WT 단백질은 약간 더 높은 T를 나타냅니다m 값(+1.1 to 1.7 °C)을 두 가지 변형과 비교할 때. 열 변성에 대한 내성은 시차 주사 형광 측정법(DSF)(간접 방법)으로도 평가되었습니다. 연구된 3개의 단백질의 열 변성 프로파일은 CD 열 변성 곡선(그림 3E)과 일치하고 용융 구형 또는 잘못 접힌 단백질에서 유래한 용매 노출 소수성 패치에 대한 증거가 없는 단일 명백한 전이를 나타냈습니다. 그러나, DSF에 의해, WT CHK2 및 두 변이체는 유사한 T를 나타내었다m 값(표 2).
연구 논문 | 제300권, 3호, 105767, 3월 2024
가족성 비골수 갑상선암에서 확인된 CHEK2 생식세포 변이체는 단백질 구조 및 기능 장애를 유발합니다.
오픈 액세스DOI:https://doi.org/10.1016/j.jbc.2024.105767
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갑상선 비수질암(NMTC)의 약 5-15%는 가족성 형태로 존재합니다(가족성 비골수 갑상선암[FNMTC]). FNMTC의 유전적 기반은 아직 많이 알려지지 않았으며, 이는 진단 및 임상 관리에 한계가 있음을 나타냅니다. 최근에는 갑상선암(TC) 환자에서 DNA 복구 관련 유전자의 생식세포 돌연변이가 밝혀져 FNMTC 병인에 대한 역할을 시사하고 있습니다. 여기에서 두 명의 FNMTC 가족이 연구되었으며, 각 가족은 TC의 영향을 받는 두 명의 구성원이 있습니다. 차세대 염기서열 분석을 통해 94개의 유전성 암 소인 유전자를 분석한 결과, 각 FNMTC 계열에서 TC로 분리된 2개의 생식세포 CHEK2 미센스 변이체(c.962A > C, p.E321A 및 c.470T > C, p.I157T)가 밝혀졌습니다. CHK2 단백질 키나아제 도메인에 위치한 p.E321A는 이전에 문헌에 보고되지 않은 희귀 변이체입니다. 반대로, CHK2 포크헤드 관련 도메인에 위치한 p.I157T는 병원성에 대한 상반된 해석을 가지고 광범위하게 설명되었습니다. CHK2 단백질(WT 및 변이체)은 생물물리학적 방법, 분자 역학 시뮬레이션 및 면역조직화학을 사용하여 특성화되었습니다. 전반적으로, 이러한 CHK2 변이체의 생물물리학적 특성 분석은 WT 단백질에 비해 구조적 및 구조적 안정성을 손상시키고 키나아제 활성을 손상시키는 것으로 나타났습니다. CHK2는 체외에서 아밀로이드 유사 피브릴로 응집되는 것으로 보이며, 이는 암 병태생리학에서 CHK2를 포지셔닝하기 위한 미래의 전망을 열어줍니다. CHK2 변이는 이러한 구조적 변화에 대해 더 높은 경향을 보였으며, 갑상선 종양에서도 더 높은 발현을 보였다. 본 연구 결과는 단백질 구조 및 기능에서 유전적 변이의 영향을 이해하기 위한 보완적 생물물리학 및 인실리코(in silico) 접근법의 유용성을 뒷받침하며, FNMTC 유전적 기반에서 CHEK2 변이체의 역할에 대한 현재 지식을 전향적 임상 번역과 함께 개선합니다.
키워드
약어:DLS(동적 광산란), DSF(시차 주사 형광 측정법), FFPE(포르말린 고정 파라핀 포매), FHA(포크헤드 관련), FND(여포성 결절성 질환), FNMTC(가족성 비골수 갑상선암), IHC(면역조직화학), LOH(이형접합성 손실), MD(분자 역학), NGS(차세대 염기서열 분석), NMTC(비골수 갑상선암), NOS-TN(갑상선 결절 없음), PDB(단백질 데이터 뱅크), PTC(갑상선 유두암), SEC(크기 배제 크로마토그래피), VUS(유의성이 불확실한 변이))
갑상선암(TC)은 가장 흔한 내분비 악성 종양으로, 전 세계 모든 암 진단의 ∼3%를 차지합니다(
). 가장 빠르게 증가하고 있는 암 유형으로, 남녀 비율이 1:3(
). 대부분의 갑상선 종양(약 95%)은 갑상선 여포 세포에서 유래하며 비수질 갑상선암(NMTC)으로 지정됩니다(
). 이러한 종양의 대부분은 산발적이지만, 모든 여포 세포 유래 갑상선 종양의 5-15%는 가족성 갑상선암으로 가족성 비골수 갑상선암(FNMTC)으로 지정됩니다. FNMTC 가족에서 환자는 양성 병변[예: 갑상선 여포성 결절성 질환(FND) 및 여포성 갑상선 선종]과 함께 TC를 나타내는 경우가 많으며, 갑상선 유두암(PTC)이 가장 빈번한 아형(
). FNMTC는 임상적 특성에 따라 증후군과 비증후군의 두 그룹으로 나눌 수 있습니다. 드물기는 하지만, 증후군 FNMTC의 기저에 있는 유전적 변형은 잘 정의되어 있습니다(
). 반대로, 비증후군 FNMTC의 유전적 배경과 임상적 행동과의 연관성은 현재 논란의 여지가 있으며 잘 이해되지 않고 있습니다(
). 비증후군 FNMTC는 세계보건기구(WHO) 분류에서 임상적으로 최소 3명의 1급 친척에게 여포 세포 유래 TC가 존재하거나 2명 이상의 1급 친척에 PTC가 존재하며, 이전의 방사선 또는 유전성 암 증후군(
). 최근 몇 년 동안 FNMTC의 병인을 더 잘 이해하기 위해 몇 가지 접근 방식이 수행되었습니다. 게놈 전반의 연관성 연구, 연계 분석, 표적 및 전체 엑솜/게놈 염기서열 분석을 통해 여러 염색체 유전자좌[MNG1(14q32), TCO(19p13.2), NMTC1(2q21), FTEN(8p23.1-p22), PRN(1q21), 6q22, 8q24 및 12q14](
)뿐만 아니라 DICER1, SRGAP1, NKX2-1, FOXE1, SRRM2, RTFC, HABP2, MYO1F, MAP2K5 및 최근에는 SPRY4와 같은 유전자의 위험 변이를 유발할 수 있습니다 (
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). 또한, DNA 복구 관련 유전자의 생식세포 변이체, 즉 BRCA1/2, ATM, CHEK2 및 MSH6가 최근 FNMTC 및 NMTC(
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), FNMTC 발병기전에서 이러한 유전자의 역할을 시사합니다. 이러한 발견에도 불구하고 FNMTC의 분자적 기초는 거의 알려지지 않았는데, 이는 이러한 유전자가 소수의 가족에서만 돌연변이를 일으켰기 때문입니다. 따라서 비증후군 가족의 경우 유전자 검사는 진단, 치료 및 후속 결정에 대한 지침에서 여전히 다루지 않습니다(
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이 연구에서는 FNMTC를 앓고 있는 포르투갈 가족 2명에서 암 소인과 관련된 94개의 유전자를 분석하기 위해 상용 패널을 사용했습니다. 이 접근법을 통해 CHEK2 유전자에서 두 가지 병원성 변이체를 식별할 수 있었습니다. CHEK2는 세린/트레오닌 단백질 키나아제 CHK2를 암호화하는 종양 억제 유전자로, DNA 이중 가닥 절단에 반응하는 DNA 손상 체크포인트의 핵심 매개체로, 게놈 무결성(
). CHEK2의 돌연변이는 산발성 암의 하위 집합에 존재할 뿐만 아니라 환자를 여러 유형의 가족성 암(
), FNMTC의 맥락에서 점점 더 많은 증거가 나타나고 있습니다(
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결과차세대 염기서열분석(NGS) 및 변이체 우선순위 지정
본 연구에서는 94개의 암 소인 유전자에서 생식세포 변이체에 대한 스크리닝을 두 FNMTC 계열의 probands의 DNA에서 수행했습니다[Family 24 (F24), individual II.1; Family 83 (F83), individual II.2] (그림 1), TruSight Cancer Kit를 사용한 NGS 분석 사용.
그림 1: CHEK2 변이체를 가진 두 FNMTC 제품군의 가계도. CHEK2 변이체 p.I157T 및 p.E321A는 각각 F24 및 F83 패밀리에서 확인되었습니다. F, 가족; FNMTC, 가족성 비골수 갑상선암.
NGS에 이어 생물정보학 분석을 실시하였다. 두 샘플에서 총 805개의 변이가 검출되었습니다. 따라서, 잠재적인 병원성 변이체를 선택하기 위해 특정 기준과 필터를 적용하여, F24에서 검출된 c.470T > C, p.I157T(엑손 4) 및 F83에서 c.962A > C, p.E321A(엑손 9)와 같은 두 개의 생식세포 체크포인트 키나아제 2(CHEK2)(NM_007194.4) 미센스 변이체를 드러냈습니다(NGS 데이터 생물정보학 분석은 지원 정보에 자세히 설명되어 있음). 두 변이체 모두 Sanger 염기서열분석으로 확인되었습니다. F83 가족에서의 분리 분석은 CHEK2 변이가 TC, 갑상선 FND 및 가족 내 달리 특정된 갑상선 결절(NOS-TN)과 분리되지 않았음을 보여주었습니다. 변이체는 프로밴드(proband)의 이형접합성(heterozygosity)에서 검출되었다(II.2; PTC), 두 자매[PTC(II.4)와 NOS-TN(II.5)]과 아들(III.1 및 III.2; FND 및 NOS-TN입니다. FND와 난소암을 보인 proband의 어머니(I.2)는 이미 사망했기 때문에 변이의 존재를 조사할 수 없었습니다. F24 계열에서 CHEK2 변이체 p.I157T는 TC로 분리되었지만 양성/NOS 갑상선 병변과는 분리되지 않았습니다. 이 변이체는 PTC를 가진 프로밴드(II.1)와 그의 여동생(II.6)의 이형접합성에서 발견되었지만, FND(II.8)와 NOS-TN(II.4)을 가진 형제자매에서는 발견되지 않았습니다. 가족의 규모가 작기 때문에 더 이상의 분리 분석은 불가능했다. 두 CHEK2 변이 모두 100명의 포르투갈 건강한 대조군에서 발견되지 않았다.
이형접합성 소실(LOH)은 암 발생에서 흔한 유전적 사건이며 많은 유전성 암 증후군에서 종양 억제 유전자의 WT 대립유전자의 체세포 불활성화에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 두 번째 히트를 조사하기 위해, CHEK2 변이 보유자로부터 이용 가능한 양성 및 악성 갑상선 병변에서 CHEK2와 관련된 LOH의 존재를 평가하였다(F24: II.1 및 II.6; F83: II.2 및 II.4). 그러나 생식세포 변이체가 환자의 종양에서 이형접합성에서 발견되었기 때문에 LOH를 암시하는 패턴은 검출되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한, F83 계열의 환자 II.4의 갑상선암(PTC)에 대한 NGS 분석에서는 체세포 CHEK2 변이가 없는 것으로 나타났다. 이는 이러한 경우 다른 기전이 종양 발생의 기저에 있을 수 있음을 나타냅니다(예: 하플로인기능부전(haploinsufficiency) 또는 우성-부정적 효과(dominant-negative effect)로 이어질 수 있는 기능 상실).
CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변형체의 인실리코(In silico) 특성 분석
정상 갑상선 조직의 단백질 및 mRNA 수준에서 CHEK2 유전자의 발현은 Human Protein Atlas 데이터베이스(표 1)에서 "medium"으로 정의됩니다. 이 연구에서 확인된 CHEK2 후보 변이체의 잠재적인 기능적 결과를 추가로 조사하여 MetaLR, Mutation Assessor 및 REVEL을 인실리코 예측 도구(SIFT, PolyPhen, MutationTaster)의 공통 세트에 추가했습니다. 단백질 기능에 대한 치환의 효과에 대한 예측은 두 가지 CHEK2 변이체에 대해 낮은 효과에서 해로운 것까지 다양했습니다(표 1). 변이체는 관련 CHK2 영역에 위치합니다: I157T 치환은 포크헤드 연관(FHA) 기능 도메인에 위치하고, E321A는 대부분의 병원성 CHEK2 변이체가 위치하는 키나아제 도메인(돌연변이 핫스팟)(
) (그림 S1A). 두 변이 모두 인구 데이터베이스에 존재하지만, p.E321A(rs374395284)는 극히 드문 반면(표 1), p.I157T(rs17879961)는 유럽 인구의 0.4%에서 보고되는 더 높은 경미한 대립유전자 빈도를 가지고 있습니다. CHK2의 비교 서열 분석은 아미노산 E321이 선택된 종들 사이에서 매우 보존되어 있는 반면(그림 S1B), I157 위치는 포유류에서는 보존되지만 더 먼 친척 유기체(예: Danio rerio)에서는 보존되지 않는 것으로 나타났으며, 이는 이 아미노산의 변화가 덜 관련성이 높은 생물학적 역할을 가질 수 있음을 시사할 수 있습니다. CHK2의 위치 157 및 321 및 그 주변에서 아미노산 치환의 내성은 SNAP2(
) 히트 맵으로 표시됩니다. 소수성에서 극성으로의 전하를 띠지 않은 변화인 이소류신에서 트레오닌으로의 치환(I157T)은 중성 효과를 가질 것으로 예측됩니다(점수 −23; 그림 S1C), 글루탐산에서 알라닌(E321A), 큰 산성 잔류물에서 작은 소수성 잔류물로의 변화는 네이티브 단백질 기능을 변화시킬 것으로 예측됩니다(점수 +56; 그림 S1C). p.E321A 및 p.I157T 변이체는 모두 ClinVar 데이터베이스에 기술되어 있으며, 각각 불확실한 유의성의 변이체(VUS)(ClinVar ID: 232111)와 병원성 해석이 상충되는 변이체(ClinVar ID: 5591)로 분류되는 반면, 데이터 집계자 VarSome은 p.E321A에 동일한 분류를 할당하고 p.I157T를 병원성 가능성이 있는 변이체로 분류했습니다(표 1). p.I157T 변이체는 유방암, 결장암, 전립선암, 위암, 신장암 및 TC를 포함한 다양한 유형의 암에서 문헌에 광범위하게 기술되어 있습니다(
). 그러나 이러한 결과에 대한 해석은 모집단(
,
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,
,
,
), 또한, 가족 내 질병과의 변이 공동 분리는 가변적입니다(
), 이전 기능 연구 통찰력은 합의되지 않았습니다(
,
,
,
,
,
). 한편, p.E321A 변이체는 데이터베이스(ClinVar ID: 232111)에서 유전성 유방암의 맥락에서 이미 기술되었음에도 불구하고 문헌에 발표되지 않았습니다(표 1). 전체적으로, p.E321A와 비교했을 때, p.I157T 변이체는 개체군에서 더 빈번하고, 진화 과정에서 덜 보존되며, 이미 병원성에 대한 가변적이고 모순된 설명을 가지고 있다.
표 1: F24 및 F83 제품군에서 NGS에 의해 식별된 두 가지 후보 CHEK2 변이체의인실리코(in silico) 특성 분석
가족유전자(RefSeq Transcript)염색체 위치(GRCh38)뉴클레오티드(CDS)아미노산(단백질)dbSNP 아이디MAF (%)단백질 기능의 변이 효과에 대한 인실리코(In silico) 예측데이터베이스의 주석정상 갑상선에서의 발현ACMG 분류최종bGnomAD/ALFA(NFE/유럽)구별폴리펜돌연변이 맛보기(Mutation Taster)메타LR돌연변이 평가자푹 빠 졌클린바(ClinVar)바솜mRNA/단백질a
F24 키 | CHEK2 (NM_007194.4) | 22: 28725099 | c.470T>씨 | p.I157T | rs17879961 (영문) | 0.2/0.4 | 불확 실한 | 해로운 | 해로운 | 해로운 | 낮다 | 불확 실한 | ClinVar ID: 5591 병원성/위험 인자에 대한 상충되는 해석: 병원성(5); 병원성 가능성이 있음(13); 병원성, 낮은 침투율(1); 확립된 위험 대립유전자(1); 불확실한 유의성(9) | 병원성 가능성 | 미디엄/미디엄 | 병원성 가능성 |
F83 키 | CHEK2 (NM_007194.4) | 22: 28699884 | c.962A>씨 | p.E321A | rs374395284 (영문) | 0.0007/0 | 불확 실한 | 해로운 | 해로운 | 양성 | 보통 | 불확 실한 | 클린 바 ID : 232111 불확실한 유의성(9) | 불확실한 중요성 | 미디엄/미디엄 | 병원성 가능성 |
약어: ACMG, American College of Medical Genetics and Genomics; CDS, 코딩 DNA 서열; MAF, 작은 대립 유전자 빈도; NFE, 논 피니시 유럽.
유전자, 전사체 및 염색체 위치는 Ensembl build 38에서 가져왔습니다.
a 「인간 단백질 지도」(The Human Protein Atlas) 데이터베이스.
b 본 연구에서 얻은 결과에 의해 뒷받침되는 최종 ACMG 분류.
이 연구에서는 TC 발달에서 두 가지 미센스 CHEK2 변이체의 역할을 더욱 명확히 하고 실리코, 데이터베이스 및 문헌 데이터에서 이미 사용할 수 있는 것 이상으로 현재 지식을 확장하기 위해 인코딩된 단백질의 기능적 및 구조적 특성 분석을 위해 생물물리학 및 MD 접근 방식을 사용했습니다.
재조합 절단 CHK2 단백질 생산
모든 재조합 절단된 CHK2 단백질((
); 도 1에 나타낸 S1A)는 배양액 리터당 1.2 내지 26mg의 정제된 단량체 단백질의 수율 범위로 성공적으로 정제되었다. CHK2 p.E321A 변이체는 정제 공정 중에 침전되는 경향이 더 높았으며, 예상되는 기능적 올리고머 형태에 비해 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에서 상당한 양의 올리고머 형태 또는 용해성 응집체를 생성했습니다(데이터 표시 안 됨). 분석적 SEC에 의해 모니터링된 올리고머 프로파일은 모든 단백질에 대해 유사했으며, 절단된 단량체에 대한 예상 분자량보다 ∼30% 높은 65kDa-단백질에 해당하는 하나의 주요 피크(WT CHK2에 대한 그림 S2 참조)를 나타냈습니다. 추가 분석은 이 올리고머 형태만을 사용하여 수행되었습니다.
CHK2 키나아제 활성에 대한 변이체의 효과
ADP-Glo Kinase 분석은 CDC25에서 유래한 펩타이드를 클라이언트 인산화 타겟으로 사용하여 키나아제 반응 중에 생성된 ADP의 양을 정량화하여 CHK2 단백질(WT, p.E321A 및 p.I157T) 키나아제 활성을 측정하기 위해 수행되었습니다. 동일한 효소 및 펩타이드 기질 농도를 사용하되 ATP 농도를 변화시킨 결과, ATP 농도에 관계없이 WT 단백질이 두 변이체와 비교할 때 더 높은 효소 활성을 나타내는 것을 관찰했습니다(그림 S3). 포화 ATP에서 CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변이체는 WT CHK2 효소 활성의 40-50%를 나타냈습니다(그림 2).
그림 2CHK2 ATPase 활동. CHK2 WT, p.E321A 및 p.I157T의 효소 활성은 상대 광 단위(RLU)로 측정되었습니다. 포화 ATP에서 CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변이체는 WT CHK2 효소 활성의 40-50%를 나타냈다. 두 개의 독립적인 분석이 세 번에 걸쳐 수행되었습니다. 오차 막대는 평균± SD를 나타냅니다.
CHK2 변이체가 단백질 구조 및 안정성에 미치는 영향
CHK2 WT, p.I157T 및 p.E321A는 유사한 원자외선 원형 이색법(CD) 스펙트럼(그림 3, A–C)을 나타내었으며, 이는 2차 구조 요소의 함량에 큰 변화가 없음을 나타냅니다. ∼210nm를 중심으로 한 국소 최솟값과 더 높은 λ에서 더 넓은 대역을 나타내는 얻어진 스펙트럼은 β 시트의 기여를 받는 주로 α나선형 구조를 나타냈으며, 이는 잘린 CHK2(
). 단백질 안정성에 대한 치환의 효과를 평가하기 위해 222nm에서 CD를 모니터링하여 열 변성 프로파일을 얻었습니다(그림 3D). 222nm 신호에서 CD가 더 음의 값으로 감소하는 것이 관찰되었는데, 이는 α-나선의 열 풀림에 대해 예상했던 것과는 다릅니다. 90°C에서 완전히 변성된 CHK2의 스펙트럼을 취함으로써 네이티브 CHK2의 주로 α나선형 스펙트럼이 218nm를 중심으로 하는 광대역으로 변환되는 것을 관찰할 수 있었으며(그림 3, A–C), 이는 불용성 세포독성 단백질 응집체인 아밀로이드 피브릴에서 발생하는 것과 같은 평행 β 시트를 나타냅니다. 변성된 단백질을 다시 20°C로 냉각했을 때, 스펙트럼은 90°C 스펙트럼과 거의 동일하게 유지되어 비가역적인 열 풀림을 나타냅니다(그림 3, A–C). 최종 열변성 구조에 관계없이, 용융 곡선(단순화를 위해 오름차순 곡선으로 표시됨)은 단상 시그모이드 곡선이 장착된 모든 단백질에 대해 단일 전이를 생성했습니다(그림 3D). 해당 Tm 값은 표 2에 제시되어 있으며, WT 단백질은 약간 더 높은 T를 나타냅니다m 값(+1.1 to 1.7 °C)을 두 가지 변형과 비교할 때. 열 변성에 대한 내성은 시차 주사 형광 측정법(DSF)(간접 방법)으로도 평가되었습니다. 연구된 3개의 단백질의 열 변성 프로파일은 CD 열 변성 곡선(그림 3E)과 일치하고 용융 구형 또는 잘못 접힌 단백질에서 유래한 용매 노출 소수성 패치에 대한 증거가 없는 단일 명백한 전이를 나타냈습니다. 그러나, DSF에 의해, WT CHK2 및 두 변이체는 유사한 T를 나타내었다m 값(표 2).
연구 논문 | 제300권, 3호, 105767, 3월 2024
가족성 비골수 갑상선암에서 확인된 CHEK2 생식세포 변이체는 단백질 구조 및 기능 장애를 유발합니다.
오픈 액세스DOI:https://doi.org/10.1016/j.jbc.2024.105767
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갑상선 비수질암(NMTC)의 약 5-15%는 가족성 형태로 존재합니다(가족성 비골수 갑상선암[FNMTC]). FNMTC의 유전적 기반은 아직 많이 알려지지 않았으며, 이는 진단 및 임상 관리에 한계가 있음을 나타냅니다. 최근에는 갑상선암(TC) 환자에서 DNA 복구 관련 유전자의 생식세포 돌연변이가 밝혀져 FNMTC 병인에 대한 역할을 시사하고 있습니다. 여기에서 두 명의 FNMTC 가족이 연구되었으며, 각 가족은 TC의 영향을 받는 두 명의 구성원이 있습니다. 차세대 염기서열 분석을 통해 94개의 유전성 암 소인 유전자를 분석한 결과, 각 FNMTC 계열에서 TC로 분리된 2개의 생식세포 CHEK2 미센스 변이체(c.962A > C, p.E321A 및 c.470T > C, p.I157T)가 밝혀졌습니다. CHK2 단백질 키나아제 도메인에 위치한 p.E321A는 이전에 문헌에 보고되지 않은 희귀 변이체입니다. 반대로, CHK2 포크헤드 관련 도메인에 위치한 p.I157T는 병원성에 대한 상반된 해석을 가지고 광범위하게 설명되었습니다. CHK2 단백질(WT 및 변이체)은 생물물리학적 방법, 분자 역학 시뮬레이션 및 면역조직화학을 사용하여 특성화되었습니다. 전반적으로, 이러한 CHK2 변이체의 생물물리학적 특성 분석은 WT 단백질에 비해 구조적 및 구조적 안정성을 손상시키고 키나아제 활성을 손상시키는 것으로 나타났습니다. CHK2는 체외에서 아밀로이드 유사 피브릴로 응집되는 것으로 보이며, 이는 암 병태생리학에서 CHK2를 포지셔닝하기 위한 미래의 전망을 열어줍니다. CHK2 변이는 이러한 구조적 변화에 대해 더 높은 경향을 보였으며, 갑상선 종양에서도 더 높은 발현을 보였다. 본 연구 결과는 단백질 구조 및 기능에서 유전적 변이의 영향을 이해하기 위한 보완적 생물물리학 및 인실리코(in silico) 접근법의 유용성을 뒷받침하며, FNMTC 유전적 기반에서 CHEK2 변이체의 역할에 대한 현재 지식을 전향적 임상 번역과 함께 개선합니다.
키워드
약어:DLS(동적 광산란), DSF(시차 주사 형광 측정법), FFPE(포르말린 고정 파라핀 포매), FHA(포크헤드 관련), FND(여포성 결절성 질환), FNMTC(가족성 비골수 갑상선암), IHC(면역조직화학), LOH(이형접합성 손실), MD(분자 역학), NGS(차세대 염기서열 분석), NMTC(비골수 갑상선암), NOS-TN(갑상선 결절 없음), PDB(단백질 데이터 뱅크), PTC(갑상선 유두암), SEC(크기 배제 크로마토그래피), VUS(유의성이 불확실한 변이))
갑상선암(TC)은 가장 흔한 내분비 악성 종양으로, 전 세계 모든 암 진단의 ∼3%를 차지합니다(
). 가장 빠르게 증가하고 있는 암 유형으로, 남녀 비율이 1:3(
). 대부분의 갑상선 종양(약 95%)은 갑상선 여포 세포에서 유래하며 비수질 갑상선암(NMTC)으로 지정됩니다(
). 이러한 종양의 대부분은 산발적이지만, 모든 여포 세포 유래 갑상선 종양의 5-15%는 가족성 갑상선암으로 가족성 비골수 갑상선암(FNMTC)으로 지정됩니다. FNMTC 가족에서 환자는 양성 병변[예: 갑상선 여포성 결절성 질환(FND) 및 여포성 갑상선 선종]과 함께 TC를 나타내는 경우가 많으며, 갑상선 유두암(PTC)이 가장 빈번한 아형(
). FNMTC는 임상적 특성에 따라 증후군과 비증후군의 두 그룹으로 나눌 수 있습니다. 드물기는 하지만, 증후군 FNMTC의 기저에 있는 유전적 변형은 잘 정의되어 있습니다(
). 반대로, 비증후군 FNMTC의 유전적 배경과 임상적 행동과의 연관성은 현재 논란의 여지가 있으며 잘 이해되지 않고 있습니다(
). 비증후군 FNMTC는 세계보건기구(WHO) 분류에서 임상적으로 최소 3명의 1급 친척에게 여포 세포 유래 TC가 존재하거나 2명 이상의 1급 친척에 PTC가 존재하며, 이전의 방사선 또는 유전성 암 증후군(
). 최근 몇 년 동안 FNMTC의 병인을 더 잘 이해하기 위해 몇 가지 접근 방식이 수행되었습니다. 게놈 전반의 연관성 연구, 연계 분석, 표적 및 전체 엑솜/게놈 염기서열 분석을 통해 여러 염색체 유전자좌[MNG1(14q32), TCO(19p13.2), NMTC1(2q21), FTEN(8p23.1-p22), PRN(1q21), 6q22, 8q24 및 12q14](
)뿐만 아니라 DICER1, SRGAP1, NKX2-1, FOXE1, SRRM2, RTFC, HABP2, MYO1F, MAP2K5 및 최근에는 SPRY4와 같은 유전자의 위험 변이를 유발할 수 있습니다 (
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). 또한, DNA 복구 관련 유전자의 생식세포 변이체, 즉 BRCA1/2, ATM, CHEK2 및 MSH6가 최근 FNMTC 및 NMTC(
,
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), FNMTC 발병기전에서 이러한 유전자의 역할을 시사합니다. 이러한 발견에도 불구하고 FNMTC의 분자적 기초는 거의 알려지지 않았는데, 이는 이러한 유전자가 소수의 가족에서만 돌연변이를 일으켰기 때문입니다. 따라서 비증후군 가족의 경우 유전자 검사는 진단, 치료 및 후속 결정에 대한 지침에서 여전히 다루지 않습니다(
,
).
이 연구에서는 FNMTC를 앓고 있는 포르투갈 가족 2명에서 암 소인과 관련된 94개의 유전자를 분석하기 위해 상용 패널을 사용했습니다. 이 접근법을 통해 CHEK2 유전자에서 두 가지 병원성 변이체를 식별할 수 있었습니다. CHEK2는 세린/트레오닌 단백질 키나아제 CHK2를 암호화하는 종양 억제 유전자로, DNA 이중 가닥 절단에 반응하는 DNA 손상 체크포인트의 핵심 매개체로, 게놈 무결성(
). CHEK2의 돌연변이는 산발성 암의 하위 집합에 존재할 뿐만 아니라 환자를 여러 유형의 가족성 암(
), FNMTC의 맥락에서 점점 더 많은 증거가 나타나고 있습니다(
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). 이 연구에서 확인된 CHK2 변이체는 생물물리학적 방법과 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 사용하여 구조적, 기능적으로 특성화되었습니다.
결과차세대 염기서열분석(NGS) 및 변이체 우선순위 지정
본 연구에서는 94개의 암 소인 유전자에서 생식세포 변이체에 대한 스크리닝을 두 FNMTC 계열의 probands의 DNA에서 수행했습니다[Family 24 (F24), individual II.1; Family 83 (F83), individual II.2] (그림 1), TruSight Cancer Kit를 사용한 NGS 분석 사용.
그림 1: CHEK2 변이체를 가진 두 FNMTC 제품군의 가계도. CHEK2 변이체 p.I157T 및 p.E321A는 각각 F24 및 F83 패밀리에서 확인되었습니다. F, 가족; FNMTC, 가족성 비골수 갑상선암.
NGS에 이어 생물정보학 분석을 실시하였다. 두 샘플에서 총 805개의 변이가 검출되었습니다. 따라서, 잠재적인 병원성 변이체를 선택하기 위해 특정 기준과 필터를 적용하여, F24에서 검출된 c.470T > C, p.I157T(엑손 4) 및 F83에서 c.962A > C, p.E321A(엑손 9)와 같은 두 개의 생식세포 체크포인트 키나아제 2(CHEK2)(NM_007194.4) 미센스 변이체를 드러냈습니다(NGS 데이터 생물정보학 분석은 지원 정보에 자세히 설명되어 있음). 두 변이체 모두 Sanger 염기서열분석으로 확인되었습니다. F83 가족에서의 분리 분석은 CHEK2 변이가 TC, 갑상선 FND 및 가족 내 달리 특정된 갑상선 결절(NOS-TN)과 분리되지 않았음을 보여주었습니다. 변이체는 프로밴드(proband)의 이형접합성(heterozygosity)에서 검출되었다(II.2; PTC), 두 자매[PTC(II.4)와 NOS-TN(II.5)]과 아들(III.1 및 III.2; FND 및 NOS-TN입니다. FND와 난소암을 보인 proband의 어머니(I.2)는 이미 사망했기 때문에 변이의 존재를 조사할 수 없었습니다. F24 계열에서 CHEK2 변이체 p.I157T는 TC로 분리되었지만 양성/NOS 갑상선 병변과는 분리되지 않았습니다. 이 변이체는 PTC를 가진 프로밴드(II.1)와 그의 여동생(II.6)의 이형접합성에서 발견되었지만, FND(II.8)와 NOS-TN(II.4)을 가진 형제자매에서는 발견되지 않았습니다. 가족의 규모가 작기 때문에 더 이상의 분리 분석은 불가능했다. 두 CHEK2 변이 모두 100명의 포르투갈 건강한 대조군에서 발견되지 않았다.
이형접합성 소실(LOH)은 암 발생에서 흔한 유전적 사건이며 많은 유전성 암 증후군에서 종양 억제 유전자의 WT 대립유전자의 체세포 불활성화에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 두 번째 히트를 조사하기 위해, CHEK2 변이 보유자로부터 이용 가능한 양성 및 악성 갑상선 병변에서 CHEK2와 관련된 LOH의 존재를 평가하였다(F24: II.1 및 II.6; F83: II.2 및 II.4). 그러나 생식세포 변이체가 환자의 종양에서 이형접합성에서 발견되었기 때문에 LOH를 암시하는 패턴은 검출되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한, F83 계열의 환자 II.4의 갑상선암(PTC)에 대한 NGS 분석에서는 체세포 CHEK2 변이가 없는 것으로 나타났다. 이는 이러한 경우 다른 기전이 종양 발생의 기저에 있을 수 있음을 나타냅니다(예: 하플로인기능부전(haploinsufficiency) 또는 우성-부정적 효과(dominant-negative effect)로 이어질 수 있는 기능 상실).
CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변형체의 인실리코(In silico) 특성 분석
정상 갑상선 조직의 단백질 및 mRNA 수준에서 CHEK2 유전자의 발현은 Human Protein Atlas 데이터베이스(표 1)에서 "medium"으로 정의됩니다. 이 연구에서 확인된 CHEK2 후보 변이체의 잠재적인 기능적 결과를 추가로 조사하여 MetaLR, Mutation Assessor 및 REVEL을 인실리코 예측 도구(SIFT, PolyPhen, MutationTaster)의 공통 세트에 추가했습니다. 단백질 기능에 대한 치환의 효과에 대한 예측은 두 가지 CHEK2 변이체에 대해 낮은 효과에서 해로운 것까지 다양했습니다(표 1). 변이체는 관련 CHK2 영역에 위치합니다: I157T 치환은 포크헤드 연관(FHA) 기능 도메인에 위치하고, E321A는 대부분의 병원성 CHEK2 변이체가 위치하는 키나아제 도메인(돌연변이 핫스팟)(
) (그림 S1A). 두 변이 모두 인구 데이터베이스에 존재하지만, p.E321A(rs374395284)는 극히 드문 반면(표 1), p.I157T(rs17879961)는 유럽 인구의 0.4%에서 보고되는 더 높은 경미한 대립유전자 빈도를 가지고 있습니다. CHK2의 비교 서열 분석은 아미노산 E321이 선택된 종들 사이에서 매우 보존되어 있는 반면(그림 S1B), I157 위치는 포유류에서는 보존되지만 더 먼 친척 유기체(예: Danio rerio)에서는 보존되지 않는 것으로 나타났으며, 이는 이 아미노산의 변화가 덜 관련성이 높은 생물학적 역할을 가질 수 있음을 시사할 수 있습니다. CHK2의 위치 157 및 321 및 그 주변에서 아미노산 치환의 내성은 SNAP2(
) 히트 맵으로 표시됩니다. 소수성에서 극성으로의 전하를 띠지 않은 변화인 이소류신에서 트레오닌으로의 치환(I157T)은 중성 효과를 가질 것으로 예측됩니다(점수 −23; 그림 S1C), 글루탐산에서 알라닌(E321A), 큰 산성 잔류물에서 작은 소수성 잔류물로의 변화는 네이티브 단백질 기능을 변화시킬 것으로 예측됩니다(점수 +56; 그림 S1C). p.E321A 및 p.I157T 변이체는 모두 ClinVar 데이터베이스에 기술되어 있으며, 각각 불확실한 유의성의 변이체(VUS)(ClinVar ID: 232111)와 병원성 해석이 상충되는 변이체(ClinVar ID: 5591)로 분류되는 반면, 데이터 집계자 VarSome은 p.E321A에 동일한 분류를 할당하고 p.I157T를 병원성 가능성이 있는 변이체로 분류했습니다(표 1). p.I157T 변이체는 유방암, 결장암, 전립선암, 위암, 신장암 및 TC를 포함한 다양한 유형의 암에서 문헌에 광범위하게 기술되어 있습니다(
). 그러나 이러한 결과에 대한 해석은 모집단(
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), 또한, 가족 내 질병과의 변이 공동 분리는 가변적입니다(
), 이전 기능 연구 통찰력은 합의되지 않았습니다(
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). 한편, p.E321A 변이체는 데이터베이스(ClinVar ID: 232111)에서 유전성 유방암의 맥락에서 이미 기술되었음에도 불구하고 문헌에 발표되지 않았습니다(표 1). 전체적으로, p.E321A와 비교했을 때, p.I157T 변이체는 개체군에서 더 빈번하고, 진화 과정에서 덜 보존되며, 이미 병원성에 대한 가변적이고 모순된 설명을 가지고 있다.
표 1: F24 및 F83 제품군에서 NGS에 의해 식별된 두 가지 후보 CHEK2 변이체의인실리코(in silico) 특성 분석
가족유전자(RefSeq Transcript)염색체 위치(GRCh38)뉴클레오티드(CDS)아미노산(단백질)dbSNP 아이디MAF (%)단백질 기능의 변이 효과에 대한 인실리코(In silico) 예측데이터베이스의 주석정상 갑상선에서의 발현ACMG 분류최종bGnomAD/ALFA(NFE/유럽)구별폴리펜돌연변이 맛보기(Mutation Taster)메타LR돌연변이 평가자푹 빠 졌클린바(ClinVar)바솜mRNA/단백질a
F24 키 | CHEK2 (NM_007194.4) | 22: 28725099 | c.470T>씨 | p.I157T | rs17879961 (영문) | 0.2/0.4 | 불확 실한 | 해로운 | 해로운 | 해로운 | 낮다 | 불확 실한 | ClinVar ID: 5591 병원성/위험 인자에 대한 상충되는 해석: 병원성(5); 병원성 가능성이 있음(13); 병원성, 낮은 침투율(1); 확립된 위험 대립유전자(1); 불확실한 유의성(9) | 병원성 가능성 | 미디엄/미디엄 | 병원성 가능성 |
F83 키 | CHEK2 (NM_007194.4) | 22: 28699884 | c.962A>씨 | p.E321A | rs374395284 (영문) | 0.0007/0 | 불확 실한 | 해로운 | 해로운 | 양성 | 보통 | 불확 실한 | 클린 바 ID : 232111 불확실한 유의성(9) | 불확실한 중요성 | 미디엄/미디엄 | 병원성 가능성 |
약어: ACMG, American College of Medical Genetics and Genomics; CDS, 코딩 DNA 서열; MAF, 작은 대립 유전자 빈도; NFE, 논 피니시 유럽.
유전자, 전사체 및 염색체 위치는 Ensembl build 38에서 가져왔습니다.
a 「인간 단백질 지도」(The Human Protein Atlas) 데이터베이스.
b 본 연구에서 얻은 결과에 의해 뒷받침되는 최종 ACMG 분류.
이 연구에서는 TC 발달에서 두 가지 미센스 CHEK2 변이체의 역할을 더욱 명확히 하고 실리코, 데이터베이스 및 문헌 데이터에서 이미 사용할 수 있는 것 이상으로 현재 지식을 확장하기 위해 인코딩된 단백질의 기능적 및 구조적 특성 분석을 위해 생물물리학 및 MD 접근 방식을 사용했습니다.
재조합 절단 CHK2 단백질 생산
모든 재조합 절단된 CHK2 단백질((
); 도 1에 나타낸 S1A)는 배양액 리터당 1.2 내지 26mg의 정제된 단량체 단백질의 수율 범위로 성공적으로 정제되었다. CHK2 p.E321A 변이체는 정제 공정 중에 침전되는 경향이 더 높았으며, 예상되는 기능적 올리고머 형태에 비해 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에서 상당한 양의 올리고머 형태 또는 용해성 응집체를 생성했습니다(데이터 표시 안 됨). 분석적 SEC에 의해 모니터링된 올리고머 프로파일은 모든 단백질에 대해 유사했으며, 절단된 단량체에 대한 예상 분자량보다 ∼30% 높은 65kDa-단백질에 해당하는 하나의 주요 피크(WT CHK2에 대한 그림 S2 참조)를 나타냈습니다. 추가 분석은 이 올리고머 형태만을 사용하여 수행되었습니다.
CHK2 키나아제 활성에 대한 변이체의 효과
ADP-Glo Kinase 분석은 CDC25에서 유래한 펩타이드를 클라이언트 인산화 타겟으로 사용하여 키나아제 반응 중에 생성된 ADP의 양을 정량화하여 CHK2 단백질(WT, p.E321A 및 p.I157T) 키나아제 활성을 측정하기 위해 수행되었습니다. 동일한 효소 및 펩타이드 기질 농도를 사용하되 ATP 농도를 변화시킨 결과, ATP 농도에 관계없이 WT 단백질이 두 변이체와 비교할 때 더 높은 효소 활성을 나타내는 것을 관찰했습니다(그림 S3). 포화 ATP에서 CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변이체는 WT CHK2 효소 활성의 40-50%를 나타냈습니다(그림 2).
그림 2CHK2 ATPase 활동. CHK2 WT, p.E321A 및 p.I157T의 효소 활성은 상대 광 단위(RLU)로 측정되었습니다. 포화 ATP에서 CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변이체는 WT CHK2 효소 활성의 40-50%를 나타냈다. 두 개의 독립적인 분석이 세 번에 걸쳐 수행되었습니다. 오차 막대는 평균± SD를 나타냅니다.
CHK2 변이체가 단백질 구조 및 안정성에 미치는 영향
CHK2 WT, p.I157T 및 p.E321A는 유사한 원자외선 원형 이색법(CD) 스펙트럼(그림 3, A–C)을 나타내었으며, 이는 2차 구조 요소의 함량에 큰 변화가 없음을 나타냅니다. ∼210nm를 중심으로 한 국소 최솟값과 더 높은 λ에서 더 넓은 대역을 나타내는 얻어진 스펙트럼은 β 시트의 기여를 받는 주로 α나선형 구조를 나타냈으며, 이는 잘린 CHK2(
). 단백질 안정성에 대한 치환의 효과를 평가하기 위해 222nm에서 CD를 모니터링하여 열 변성 프로파일을 얻었습니다(그림 3D). 222nm 신호에서 CD가 더 음의 값으로 감소하는 것이 관찰되었는데, 이는 α-나선의 열 풀림에 대해 예상했던 것과는 다릅니다. 90°C에서 완전히 변성된 CHK2의 스펙트럼을 취함으로써 네이티브 CHK2의 주로 α나선형 스펙트럼이 218nm를 중심으로 하는 광대역으로 변환되는 것을 관찰할 수 있었으며(그림 3, A–C), 이는 불용성 세포독성 단백질 응집체인 아밀로이드 피브릴에서 발생하는 것과 같은 평행 β 시트를 나타냅니다. 변성된 단백질을 다시 20°C로 냉각했을 때, 스펙트럼은 90°C 스펙트럼과 거의 동일하게 유지되어 비가역적인 열 풀림을 나타냅니다(그림 3, A–C). 최종 열변성 구조에 관계없이, 용융 곡선(단순화를 위해 오름차순 곡선으로 표시됨)은 단상 시그모이드 곡선이 장착된 모든 단백질에 대해 단일 전이를 생성했습니다(그림 3D). 해당 Tm 값은 표 2에 제시되어 있으며, WT 단백질은 약간 더 높은 T를 나타냅니다m 값(+1.1 to 1.7 °C)을 두 가지 변형과 비교할 때. 열 변성에 대한 내성은 시차 주사 형광 측정법(DSF)(간접 방법)으로도 평가되었습니다. 연구된 3개의 단백질의 열 변성 프로파일은 CD 열 변성 곡선(그림 3E)과 일치하고 용융 구형 또는 잘못 접힌 단백질에서 유래한 용매 노출 소수성 패치에 대한 증거가 없는 단일 명백한 전이를 나타냈습니다. 그러나, DSF에 의해, WT CHK2 및 두 변이체는 유사한 T를 나타내었다m 값(표 2).
연구 논문 | 제300권, 3호, 105767, 3월 2024
가족성 비골수 갑상선암에서 확인된 CHEK2 생식세포 변이체는 단백질 구조 및 기능 장애를 유발합니다.
오픈 액세스DOI:https://doi.org/10.1016/j.jbc.2024.105767
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갑상선 비수질암(NMTC)의 약 5-15%는 가족성 형태로 존재합니다(가족성 비골수 갑상선암[FNMTC]). FNMTC의 유전적 기반은 아직 많이 알려지지 않았으며, 이는 진단 및 임상 관리에 한계가 있음을 나타냅니다. 최근에는 갑상선암(TC) 환자에서 DNA 복구 관련 유전자의 생식세포 돌연변이가 밝혀져 FNMTC 병인에 대한 역할을 시사하고 있습니다. 여기에서 두 명의 FNMTC 가족이 연구되었으며, 각 가족은 TC의 영향을 받는 두 명의 구성원이 있습니다. 차세대 염기서열 분석을 통해 94개의 유전성 암 소인 유전자를 분석한 결과, 각 FNMTC 계열에서 TC로 분리된 2개의 생식세포 CHEK2 미센스 변이체(c.962A > C, p.E321A 및 c.470T > C, p.I157T)가 밝혀졌습니다. CHK2 단백질 키나아제 도메인에 위치한 p.E321A는 이전에 문헌에 보고되지 않은 희귀 변이체입니다. 반대로, CHK2 포크헤드 관련 도메인에 위치한 p.I157T는 병원성에 대한 상반된 해석을 가지고 광범위하게 설명되었습니다. CHK2 단백질(WT 및 변이체)은 생물물리학적 방법, 분자 역학 시뮬레이션 및 면역조직화학을 사용하여 특성화되었습니다. 전반적으로, 이러한 CHK2 변이체의 생물물리학적 특성 분석은 WT 단백질에 비해 구조적 및 구조적 안정성을 손상시키고 키나아제 활성을 손상시키는 것으로 나타났습니다. CHK2는 체외에서 아밀로이드 유사 피브릴로 응집되는 것으로 보이며, 이는 암 병태생리학에서 CHK2를 포지셔닝하기 위한 미래의 전망을 열어줍니다. CHK2 변이는 이러한 구조적 변화에 대해 더 높은 경향을 보였으며, 갑상선 종양에서도 더 높은 발현을 보였다. 본 연구 결과는 단백질 구조 및 기능에서 유전적 변이의 영향을 이해하기 위한 보완적 생물물리학 및 인실리코(in silico) 접근법의 유용성을 뒷받침하며, FNMTC 유전적 기반에서 CHEK2 변이체의 역할에 대한 현재 지식을 전향적 임상 번역과 함께 개선합니다.
키워드
약어:DLS(동적 광산란), DSF(시차 주사 형광 측정법), FFPE(포르말린 고정 파라핀 포매), FHA(포크헤드 관련), FND(여포성 결절성 질환), FNMTC(가족성 비골수 갑상선암), IHC(면역조직화학), LOH(이형접합성 손실), MD(분자 역학), NGS(차세대 염기서열 분석), NMTC(비골수 갑상선암), NOS-TN(갑상선 결절 없음), PDB(단백질 데이터 뱅크), PTC(갑상선 유두암), SEC(크기 배제 크로마토그래피), VUS(유의성이 불확실한 변이))
갑상선암(TC)은 가장 흔한 내분비 악성 종양으로, 전 세계 모든 암 진단의 ∼3%를 차지합니다(
). 가장 빠르게 증가하고 있는 암 유형으로, 남녀 비율이 1:3(
). 대부분의 갑상선 종양(약 95%)은 갑상선 여포 세포에서 유래하며 비수질 갑상선암(NMTC)으로 지정됩니다(
). 이러한 종양의 대부분은 산발적이지만, 모든 여포 세포 유래 갑상선 종양의 5-15%는 가족성 갑상선암으로 가족성 비골수 갑상선암(FNMTC)으로 지정됩니다. FNMTC 가족에서 환자는 양성 병변[예: 갑상선 여포성 결절성 질환(FND) 및 여포성 갑상선 선종]과 함께 TC를 나타내는 경우가 많으며, 갑상선 유두암(PTC)이 가장 빈번한 아형(
). FNMTC는 임상적 특성에 따라 증후군과 비증후군의 두 그룹으로 나눌 수 있습니다. 드물기는 하지만, 증후군 FNMTC의 기저에 있는 유전적 변형은 잘 정의되어 있습니다(
). 반대로, 비증후군 FNMTC의 유전적 배경과 임상적 행동과의 연관성은 현재 논란의 여지가 있으며 잘 이해되지 않고 있습니다(
). 비증후군 FNMTC는 세계보건기구(WHO) 분류에서 임상적으로 최소 3명의 1급 친척에게 여포 세포 유래 TC가 존재하거나 2명 이상의 1급 친척에 PTC가 존재하며, 이전의 방사선 또는 유전성 암 증후군(
). 최근 몇 년 동안 FNMTC의 병인을 더 잘 이해하기 위해 몇 가지 접근 방식이 수행되었습니다. 게놈 전반의 연관성 연구, 연계 분석, 표적 및 전체 엑솜/게놈 염기서열 분석을 통해 여러 염색체 유전자좌[MNG1(14q32), TCO(19p13.2), NMTC1(2q21), FTEN(8p23.1-p22), PRN(1q21), 6q22, 8q24 및 12q14](
)뿐만 아니라 DICER1, SRGAP1, NKX2-1, FOXE1, SRRM2, RTFC, HABP2, MYO1F, MAP2K5 및 최근에는 SPRY4와 같은 유전자의 위험 변이를 유발할 수 있습니다 (
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). 또한, DNA 복구 관련 유전자의 생식세포 변이체, 즉 BRCA1/2, ATM, CHEK2 및 MSH6가 최근 FNMTC 및 NMTC(
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,
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), FNMTC 발병기전에서 이러한 유전자의 역할을 시사합니다. 이러한 발견에도 불구하고 FNMTC의 분자적 기초는 거의 알려지지 않았는데, 이는 이러한 유전자가 소수의 가족에서만 돌연변이를 일으켰기 때문입니다. 따라서 비증후군 가족의 경우 유전자 검사는 진단, 치료 및 후속 결정에 대한 지침에서 여전히 다루지 않습니다(
,
).
이 연구에서는 FNMTC를 앓고 있는 포르투갈 가족 2명에서 암 소인과 관련된 94개의 유전자를 분석하기 위해 상용 패널을 사용했습니다. 이 접근법을 통해 CHEK2 유전자에서 두 가지 병원성 변이체를 식별할 수 있었습니다. CHEK2는 세린/트레오닌 단백질 키나아제 CHK2를 암호화하는 종양 억제 유전자로, DNA 이중 가닥 절단에 반응하는 DNA 손상 체크포인트의 핵심 매개체로, 게놈 무결성(
). CHEK2의 돌연변이는 산발성 암의 하위 집합에 존재할 뿐만 아니라 환자를 여러 유형의 가족성 암(
), FNMTC의 맥락에서 점점 더 많은 증거가 나타나고 있습니다(
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). 이 연구에서 확인된 CHK2 변이체는 생물물리학적 방법과 분자 역학(MD) 시뮬레이션을 사용하여 구조적, 기능적으로 특성화되었습니다.
결과차세대 염기서열분석(NGS) 및 변이체 우선순위 지정
본 연구에서는 94개의 암 소인 유전자에서 생식세포 변이체에 대한 스크리닝을 두 FNMTC 계열의 probands의 DNA에서 수행했습니다[Family 24 (F24), individual II.1; Family 83 (F83), individual II.2] (그림 1), TruSight Cancer Kit를 사용한 NGS 분석 사용.
그림 1: CHEK2 변이체를 가진 두 FNMTC 제품군의 가계도. CHEK2 변이체 p.I157T 및 p.E321A는 각각 F24 및 F83 패밀리에서 확인되었습니다. F, 가족; FNMTC, 가족성 비골수 갑상선암.
NGS에 이어 생물정보학 분석을 실시하였다. 두 샘플에서 총 805개의 변이가 검출되었습니다. 따라서, 잠재적인 병원성 변이체를 선택하기 위해 특정 기준과 필터를 적용하여, F24에서 검출된 c.470T > C, p.I157T(엑손 4) 및 F83에서 c.962A > C, p.E321A(엑손 9)와 같은 두 개의 생식세포 체크포인트 키나아제 2(CHEK2)(NM_007194.4) 미센스 변이체를 드러냈습니다(NGS 데이터 생물정보학 분석은 지원 정보에 자세히 설명되어 있음). 두 변이체 모두 Sanger 염기서열분석으로 확인되었습니다. F83 가족에서의 분리 분석은 CHEK2 변이가 TC, 갑상선 FND 및 가족 내 달리 특정된 갑상선 결절(NOS-TN)과 분리되지 않았음을 보여주었습니다. 변이체는 프로밴드(proband)의 이형접합성(heterozygosity)에서 검출되었다(II.2; PTC), 두 자매[PTC(II.4)와 NOS-TN(II.5)]과 아들(III.1 및 III.2; FND 및 NOS-TN입니다. FND와 난소암을 보인 proband의 어머니(I.2)는 이미 사망했기 때문에 변이의 존재를 조사할 수 없었습니다. F24 계열에서 CHEK2 변이체 p.I157T는 TC로 분리되었지만 양성/NOS 갑상선 병변과는 분리되지 않았습니다. 이 변이체는 PTC를 가진 프로밴드(II.1)와 그의 여동생(II.6)의 이형접합성에서 발견되었지만, FND(II.8)와 NOS-TN(II.4)을 가진 형제자매에서는 발견되지 않았습니다. 가족의 규모가 작기 때문에 더 이상의 분리 분석은 불가능했다. 두 CHEK2 변이 모두 100명의 포르투갈 건강한 대조군에서 발견되지 않았다.
이형접합성 소실(LOH)은 암 발생에서 흔한 유전적 사건이며 많은 유전성 암 증후군에서 종양 억제 유전자의 WT 대립유전자의 체세포 불활성화에 관여하는 것으로 알려져 있습니다. 두 번째 히트를 조사하기 위해, CHEK2 변이 보유자로부터 이용 가능한 양성 및 악성 갑상선 병변에서 CHEK2와 관련된 LOH의 존재를 평가하였다(F24: II.1 및 II.6; F83: II.2 및 II.4). 그러나 생식세포 변이체가 환자의 종양에서 이형접합성에서 발견되었기 때문에 LOH를 암시하는 패턴은 검출되지 않았습니다(데이터는 표시되지 않음). 또한, F83 계열의 환자 II.4의 갑상선암(PTC)에 대한 NGS 분석에서는 체세포 CHEK2 변이가 없는 것으로 나타났다. 이는 이러한 경우 다른 기전이 종양 발생의 기저에 있을 수 있음을 나타냅니다(예: 하플로인기능부전(haploinsufficiency) 또는 우성-부정적 효과(dominant-negative effect)로 이어질 수 있는 기능 상실).
CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변형체의 인실리코(In silico) 특성 분석
정상 갑상선 조직의 단백질 및 mRNA 수준에서 CHEK2 유전자의 발현은 Human Protein Atlas 데이터베이스(표 1)에서 "medium"으로 정의됩니다. 이 연구에서 확인된 CHEK2 후보 변이체의 잠재적인 기능적 결과를 추가로 조사하여 MetaLR, Mutation Assessor 및 REVEL을 인실리코 예측 도구(SIFT, PolyPhen, MutationTaster)의 공통 세트에 추가했습니다. 단백질 기능에 대한 치환의 효과에 대한 예측은 두 가지 CHEK2 변이체에 대해 낮은 효과에서 해로운 것까지 다양했습니다(표 1). 변이체는 관련 CHK2 영역에 위치합니다: I157T 치환은 포크헤드 연관(FHA) 기능 도메인에 위치하고, E321A는 대부분의 병원성 CHEK2 변이체가 위치하는 키나아제 도메인(돌연변이 핫스팟)(30) (그림 S1A). 두 변이 모두 인구 데이터베이스에 존재하지만, p.E321A(rs374395284)는 극히 드문 반면(표 1), p.I157T(rs17879961)는 유럽 인구의 0.4%에서 보고되는 더 높은 경미한 대립유전자 빈도를 가지고 있습니다. CHK2의 비교 서열 분석은 아미노산 E321이 선택된 종들 사이에서 매우 보존되어 있는 반면(그림 S1B), I157 위치는 포유류에서는 보존되지만 더 먼 친척 유기체(예: Danio rerio)에서는 보존되지 않는 것으로 나타났으며, 이는 이 아미노산의 변화가 덜 관련성이 높은 생물학적 역할을 가질 수 있음을 시사할 수 있습니다. CHK2의 위치 157 및 321 및 그 주변에서 아미노산 치환의 내성은 SNAP2(31) 히트 맵으로 표시됩니다. 소수성에서 극성으로의 전하를 띠지 않은 변화인 이소류신에서 트레오닌으로의 치환(I157T)은 중성 효과를 가질 것으로 예측됩니다(점수 −23; 그림 S1C), 글루탐산에서 알라닌(E321A), 큰 산성 잔류물에서 작은 소수성 잔류물로의 변화는 네이티브 단백질 기능을 변화시킬 것으로 예측됩니다(점수 +56; 그림 S1C). p.E321A 및 p.I157T 변이체는 모두 ClinVar 데이터베이스에 기술되어 있으며, 각각 불확실한 유의성의 변이체(VUS)(ClinVar ID: 232111)와 병원성 해석이 상충되는 변이체(ClinVar ID: 5591)로 분류되는 반면, 데이터 집계자 VarSome은 p.E321A에 동일한 분류를 할당하고 p.I157T를 병원성 가능성이 있는 변이체로 분류했습니다(표 1). p.I157T 변이체는 유방암, 결장암, 전립선암, 위암, 신장암 및 TC를 포함한 다양한 유형의 암에서 문헌에 광범위하게 기술되어 있습니다(32). 그러나 이러한 결과에 대한 해석은 모집단(33, 34, 35, 36, 37, 38), 또한, 가족 내 질병과의 변이 공동 분리는 가변적입니다(39), 이전 기능 연구 통찰력은 합의되지 않았습니다(39, 40, 41, 42, 43, 44). 한편, p.E321A 변이체는 데이터베이스(ClinVar ID: 232111)에서 유전성 유방암의 맥락에서 이미 기술되었음에도 불구하고 문헌에 발표되지 않았습니다(표 1). 전체적으로, p.E321A와 비교했을 때, p.I157T 변이체는 개체군에서 더 빈번하고, 진화 과정에서 덜 보존되며, 이미 병원성에 대한 가변적이고 모순된 설명을 가지고 있다.
표 1: F24 및 F83 제품군에서 NGS에 의해 식별된 두 가지 후보 CHEK2 변이체의인실리코(in silico) 특성 분석
가족유전자(RefSeq Transcript)염색체 위치(GRCh38)뉴클레오티드(CDS)아미노산(단백질)dbSNP 아이디MAF (%)단백질 기능의 변이 효과에 대한 인실리코(In silico) 예측데이터베이스의 주석정상 갑상선에서의 발현ACMG 분류최종bGnomAD/ALFA(NFE/유럽)구별폴리펜돌연변이 맛보기(Mutation Taster)메타LR돌연변이 평가자푹 빠 졌클린바(ClinVar)바솜mRNA/단백질a
F24 키 | CHEK2 (NM_007194.4) | 22: 28725099 | c.470T>씨 | p.I157T | rs17879961 (영문) | 0.2/0.4 | 불확 실한 | 해로운 | 해로운 | 해로운 | 낮다 | 불확 실한 | ClinVar ID: 5591 병원성/위험 인자에 대한 상충되는 해석: 병원성(5); 병원성 가능성이 있음(13); 병원성, 낮은 침투율(1); 확립된 위험 대립유전자(1); 불확실한 유의성(9) | 병원성 가능성 | 미디엄/미디엄 | 병원성 가능성 |
F83 키 | CHEK2 (NM_007194.4) | 22: 28699884 | c.962A>씨 | p.E321A | rs374395284 (영문) | 0.0007/0 | 불확 실한 | 해로운 | 해로운 | 양성 | 보통 | 불확 실한 | 클린 바 ID : 232111 불확실한 유의성(9) | 불확실한 중요성 | 미디엄/미디엄 | 병원성 가능성 |
약어: ACMG, American College of Medical Genetics and Genomics; CDS, 코딩 DNA 서열; MAF, 작은 대립 유전자 빈도; NFE, 논 피니시 유럽.
유전자, 전사체 및 염색체 위치는 Ensembl build 38에서 가져왔습니다.
a 「인간 단백질 지도」(The Human Protein Atlas) 데이터베이스.
b 본 연구에서 얻은 결과에 의해 뒷받침되는 최종 ACMG 분류.
이 연구에서는 TC 발달에서 두 가지 미센스 CHEK2 변이체의 역할을 더욱 명확히 하고 실리코, 데이터베이스 및 문헌 데이터에서 이미 사용할 수 있는 것 이상으로 현재 지식을 확장하기 위해 인코딩된 단백질의 기능적 및 구조적 특성 분석을 위해 생물물리학 및 MD 접근 방식을 사용했습니다.
재조합 절단 CHK2 단백질 생산
모든 재조합 절단된 CHK2 단백질((45); 도 1에 나타낸 S1A)는 배양액 리터당 1.2 내지 26mg의 정제된 단량체 단백질의 수율 범위로 성공적으로 정제되었다. CHK2 p.E321A 변이체는 정제 공정 중에 침전되는 경향이 더 높았으며, 예상되는 기능적 올리고머 형태에 비해 분취용 크기 배제 크로마토그래피(SEC)에서 상당한 양의 올리고머 형태 또는 용해성 응집체를 생성했습니다(데이터 표시 안 됨). 분석적 SEC에 의해 모니터링된 올리고머 프로파일은 모든 단백질에 대해 유사했으며, 절단된 단량체에 대한 예상 분자량보다 ∼30% 높은 65kDa-단백질에 해당하는 하나의 주요 피크(WT CHK2에 대한 그림 S2 참조)를 나타냈습니다. 추가 분석은 이 올리고머 형태만을 사용하여 수행되었습니다.
CHK2 키나아제 활성에 대한 변이체의 효과
ADP-Glo Kinase 분석은 CDC25에서 유래한 펩타이드를 클라이언트 인산화 타겟으로 사용하여 키나아제 반응 중에 생성된 ADP의 양을 정량화하여 CHK2 단백질(WT, p.E321A 및 p.I157T) 키나아제 활성을 측정하기 위해 수행되었습니다. 동일한 효소 및 펩타이드 기질 농도를 사용하되 ATP 농도를 변화시킨 결과, ATP 농도에 관계없이 WT 단백질이 두 변이체와 비교할 때 더 높은 효소 활성을 나타내는 것을 관찰했습니다(그림 S3). 포화 ATP에서 CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변이체는 WT CHK2 효소 활성의 40-50%를 나타냈습니다(그림 2).
그림 2CHK2 ATPase 활동. CHK2 WT, p.E321A 및 p.I157T의 효소 활성은 상대 광 단위(RLU)로 측정되었습니다. 포화 ATP에서 CHK2 p.I157T 및 p.E321A 변이체는 WT CHK2 효소 활성의 40-50%를 나타냈다. 두 개의 독립적인 분석이 세 번에 걸쳐 수행되었습니다. 오차 막대는 평균± SD를 나타냅니다.
CHK2 변이체가 단백질 구조 및 안정성에 미치는 영향
CHK2 WT, p.I157T 및 p.E321A는 유사한 원자외선 원형 이색법(CD) 스펙트럼(그림 3, A–C)을 나타내었으며, 이는 2차 구조 요소의 함량에 큰 변화가 없음을 나타냅니다. ∼210nm를 중심으로 한 국소 최솟값과 더 높은 λ에서 더 넓은 대역을 나타내는 얻어진 스펙트럼은 β 시트의 기여를 받는 주로 α나선형 구조를 나타냈으며, 이는 잘린 CHK2(
). 단백질 안정성에 대한 치환의 효과를 평가하기 위해 222nm에서 CD를 모니터링하여 열 변성 프로파일을 얻었습니다(그림 3D). 222nm 신호에서 CD가 더 음의 값으로 감소하는 것이 관찰되었는데, 이는 α-나선의 열 풀림에 대해 예상했던 것과는 다릅니다. 90°C에서 완전히 변성된 CHK2의 스펙트럼을 취함으로써 네이티브 CHK2의 주로 α나선형 스펙트럼이 218nm를 중심으로 하는 광대역으로 변환되는 것을 관찰할 수 있었으며(그림 3, A–C), 이는 불용성 세포독성 단백질 응집체인 아밀로이드 피브릴에서 발생하는 것과 같은 평행 β 시트를 나타냅니다. 변성된 단백질을 다시 20°C로 냉각했을 때, 스펙트럼은 90°C 스펙트럼과 거의 동일하게 유지되어 비가역적인 열 풀림을 나타냅니다(그림 3, A–C). 최종 열변성 구조에 관계없이, 용융 곡선(단순화를 위해 오름차순 곡선으로 표시됨)은 단상 시그모이드 곡선이 장착된 모든 단백질에 대해 단일 전이를 생성했습니다(그림 3D). 해당 Tm 값은 표 2에 제시되어 있으며, WT 단백질은 약간 더 높은 T를 나타냅니다m 값(+1.1 to 1.7 °C)을 두 가지 변형과 비교할 때. 열 변성에 대한 내성은 시차 주사 형광 측정법(DSF)(간접 방법)으로도 평가되었습니다. 연구된 3개의 단백질의 열 변성 프로파일은 CD 열 변성 곡선(그림 3E)과 일치하고 용융 구형 또는 잘못 접힌 단백질에서 유래한 용매 노출 소수성 패치에 대한 증거가 없는 단일 명백한 전이를 나타냈습니다. 그러나, DSF에 의해, WT CHK2 및 두 변이체는 유사한 T를 나타내었다m 값(표 2).