|
8. 질소고정균
생물에 의한 질소고정은 태양광선 에너지와 공기 중의
질소를 이용, 고정하여 식물에 질소화합물을 제공한다는 점에서, 오늘날 식량증산 및 지구오염 개선등에 있어 크게 주목받고 있다.
질소고정생물을 생태학적으로 분류하면 아래의 표와 같으며 여기에서는 주요 질소고정 미생물의 계수 및 분리에 대해 기술하고자
한다.
표 8 - 1 질소고정 생물의 생태학적 분류
단생 질소고정생물
세균(3목,11과, 26속)
-
호 기 성 균 : Azotobacter,
Beijerikia, Derxia, Azospirillum
-
통성혐기성균 : Klebsiella,
Pneumoniae, Bacillus Polymyxa
-
절대혐기성균 : Clostridium,
Pasteurianum, Desulfovibrio
-
광합성 세균 : Chromatium,
Rhodospirillum, Chlorobium
남조
-
헤테로시스를 갖는 섬유상 남조 : Anabaena,
Nostoc, Calithrix
-
헤테로시스를 갖지 않는 섬유상 남조 :
Tricodesmium, Plectonema
-
단세포남조 :
Gloeocapsa |
공생질소고정생물
|
비콩과식물
-
피자식물과 Frankia의 근류 : 오리나무, 목마황,
보리수나무
-
나자식물의 근류 : 세균 또는 사상균, 소철 -
남조
-
엽류 : Psychotria -
Klebsiella
-
남조와의 공생 : 지의(사상균 - 남조), Azolla
- Anabaena
-
근권에서의 약한 공생 : Digitaria
decumbens - Azospirillum lipoferum |
세균과의 공생
|
8.1 단생 질소 고정균
8.1.1 Azotobacter
8.1.1.1 계수
Azotobacter는 질소고정력이 있으므로 무질소배지를 이용하여
생육시킨다. 질소고정력이 없는 균종은 무질소배지에서 생육하지 않으므로 계수측정이 용이하다. 희석평판법으로 1∼2주가
배양한다.(매우 작은 콜로니는 비질소고정균인 경우가 많다.) 그러나 이때 계수된 콜로니 가운데는 Azotobacter이외의
질소고정균이 존재한다고 보고되고 있으므로 다음에 기술하는 분리법으로 Azotobacter로서의 특징을 조사한 다음 계수치를 확인할
필요가 있다.
8.1.1.2 분리
토양시료 1g(또는 시료액 20mℓ)정도를 Azotobacter
무질소기초배지 100 mℓ에 첨가하여 25∼30℃ 암실에서 진탕배양시켜 이것을 다시 직접 배양한다. 정치배양하면 표면에 피막을
형성하여 세포가 서로 부착되어 콜로니를 분리할 수 없다.
최초의 배양기 중에는 비질소고정의 유기영양미생물이 섞여 있으므로 이식과
진탕배양을 수회 반복한 후 평판법으로 콜로니를 형성시킨다. 배양 후 오랫동안 방치하면, 질소를 고정하여 증식된 균체에서 분비하는
물질을 이용하여 생육하는 비질소고정균이 생육되기도 하므로 분리배양을 하여 질소고정균의 대수증식기 후반까지의 것을 차례로 이식하여
최종적으로 희석평판법에 의해 분리한다.
A. chroococum의 생육을 선택적으로 촉진할 경우에는 전분을 1%,
A. vinelandii의 생육촉진에는 rhamnose를 사용한다. A. beijerinkia , A.
maerocytogenes를 선택할 경우에는 sucrose를 가한 후 pH 5.0∼6.0으로 하여 배양시키는 것이
좋다.
표 8 - 2 Azotobacter종의 특징
균종 |
세포크기 |
Microyst 형성 |
편모 |
색
소 |
서식처 |
비수용성 |
수용성 |
형광색 |
A.agillis |
3∼5 |
- |
주변 |
- |
녹색 |
청백색 |
물 |
A.insingnis |
3∼5 |
- |
극성 |
연갈색 |
녹색 |
- |
물 |
A.vinelandii |
2.4¡0.5 |
+ |
주변 |
- |
녹색 |
황녹색 |
물,토양 |
A.macrocytogenes |
2 |
- |
극성 |
- |
자색 |
N.R |
토양 |
A.chroococcum |
2.4×0.5 |
+ |
주변 |
갈색 |
- |
- |
물,토양 |
A.beijerinkia |
2.4¡7.6 |
+ |
비운동성 |
연갈색 |
- |
- |
물,토양 |
8.1.2 질소고정성 Clostrodoum 계수와 분리
8.1.2.1 계수
Clostrodoum 중 비질소고정성인 것은 병원성이 있는 것을 포함하여
그리 많지 않은 종이 보고되고 있으나, 질소고정능이 있는 것은 다음 표와 같이 그다지 많지 않다.
질소고정성 Clostrodoum의 배양액을 사용하여
N2가스를 포함한 혐기상태에서 희석평판법이나 희석빈도법 등으로 쉽게 계수한다. 배양법은 혐기배양법에
준한다.
표 8 - 3 질소고정성 Clostridium
C. butyricum
C. acetobutylicum
C. lactoacetophilum
C.
pectinovorum |
C. beijerinckii
C. kluyveri
C.
tetanomorphum |
C. pasteurianum
C. madisonii
C.
felsineum |
8.1.2.2 분리
토양(약1∼5g) 또는 시료용액(1∼5mℓ)를 무질소배지 약
50mℓ(200∼300 mℓ 삼각플라스크)에 넣고 산소를 완전히 제거하고 질소로 치환한다. 30℃ 전후로 배양을 하며 이식을 여러
차례 반복하여 질소고정성 Clostrodoum을 영양배양한다.
다음에 혐기상태하에서 한천배지법으로 콜로니를 분리하여 여러 차례 반복
순수분리한다.
8.1.3 질소고정성 남조의 계수와 분리
질소고정성 남조는 생물계에서 두 가지의 중요한 동화작용을 하는데, 광합성
작용과 질소고정작용이다.
표 8 - 4 질소고정성 남조류
|
공 생 하 는 생 물 속 명 |
남 조 속 명 |
사상균(지의류) |
Ascomycetes(자낭균)
Basidiomycetes(담자균)
Fungi imperfecti(불완전균)
Phycomycetes(조균) |
Calothrix, Chroococcus
Dichothrix, Gloeocapsa, Hyella,
Nostoc
Scytonema, Stigonema
Nostoc |
선 태 류 |
Anthoceros
Blasia
Cavicularia |
Nostoc, Anabaena |
양 치 류 |
Azolla(물개구리 밥) |
Anabaena axollae |
나 자 식 물 |
Bowenia, Ceratozamia
Cycas(소철), Dioon
Encephalartos, Macrozamia
Stangeria, Zamia |
Nostoc, Anabaena |
피 자 식 물 |
Gunnera |
Nostoc
punctiforme |
위의 표는 일반적으로 계수.분리되는 남조와 공생하는 식물을 나타낸
것이다.
8.1.3.1 배양액
모든 남조류에 맞는 배양액을 없으므로 각각 대상으로 하는 남조류에 적합한
배양액을 사용한다.
8.1.3.2 계수
남조에는 사상의 군체가 되거나, pectin 모양의 물질을 분비하여
덩어리형태나 막의 형태로 되는 것이 있으므로 시료를 homogenizer로 분산균일화한 후 접종할 필요가 있다. 토양시료 1g
혹은 시료용액 1㎖를 남조무질소배지 8㎖에 첨가하고, 여러 단계의 농도로 희석하여 희석빈도법이나 희석평판법으로 세포수를
계수한다.
8.1.3.3 분리
시료토양 수 g 또는 시료용액 수 ㎖를 남조 무질소배지 5㎖에 첨가하여,
조명조건하에서 약간 통기배양하면, 3주∼2개월 후에는 질소고정성 남조류가 생육한다. 최초의 배양에는 비질소고정 조류도 공존하므로
여러 차례 집적 배양을 반복한다.
남조류 주변에는 점성물질이 있어 보통 그 중간에 각 종의 유기영양미생물이
공존하게 되므로 이것을 제거할 필요가 있다.
이 때는 배양액을 교반시키면서 자외선을 수 시간 또는 수 일간 조사한
후(20W 자외선등을 약 25∼35cm 정도의 거리에서 조사), 새로운 살균배지에 접종하면 유기영양성잡균이 사멸된다. 또는 수백
ppm 또는 수천 ppm농도의 항생물질 - 예를 들어 페니실린, 스트렙토마이신, 클로람페니콜 등 - 에 수 십분 내지는 수 시간
넣어두면 잡균이 사멸되기도 한다. 잡균제거 처리 후 잡균의 존재 유무를 유기영양세균용배지에 접종하여 판정한다. (잡균중에는
질소고정능을 가지고 있는 유기영양세균도 있으므로 무질소영양배지도 시험할 필요가 있다.)
이러한 방법으로 잡균이 제거되어 순수분리가 된 남조 세포은 일시적으로
질소고정성이 강해지거나 생육이 매우 불량하게 되므로, 남조 무질소배지에 질산암모늄(미량 0.5g/ℓ정도)혹은 그 밖의 화합태질소를
첨가하여 배양한 후 희석평판법(광조명조작하)이나 사주평판법(광조명조작하)으로 질소고정성 남조를 순수분리하여
동정한다.
8.2 공생질소고정 근류균
근류균을 분리하는 방법은 크게 토양에서 직접
분리하는 법과 근류로부터 분리하는 방법으로 나눌 수 있다.
토양에서 근류균을 직접 분리하는 방법으로는 많은 선택배지가 사용되고 있지만
평판배지상에서는 토양중에 서식하고 있는 비슷한 균과의 구별이 어렵다. 근류에서 분리하는 방법에는 토양 또는 토양 희석액을
두과식물의 종자에 접종하여 근류를 착생시켜 분리하는 법과 자생 또는 재배되고 있는 두과식물에서 근류를 채취하여 근류균을 분리하는
방법이 있다. 여기서는 근류에서 분리하는 방법에 대하여 설명하고자 한다.
8.2.1근류채취
근류채취시기는 봄부터 초여름까지가 가장 적당하다. 그 이유는 근류는
지상부가 개화기를 지나면 파괴되어 근류중의 근류균이 다시 토양으로 환원되기 때문에 그 이전 또는 질소고정이 왕성한 시기에 신선한
근류를 채취한다.
근류의 표면에는 토양입자 뿐만 아니라 많은 잡균이 부착되어
있으므로 우선 근류를 깨끗이 물로 씻어내어 토양입자를 제거한다. 근류표면이 약하거나 작은 것은 어느 정도 물로 씻은 다음
소형용기에 넣고 용기의 1/3 정도가 되게 물을 넣고 용기를 가볍게 진탕시키며 용기내에서 수회 반복 세척한다. 근류가 작은
경우에는 세척에 이용된 용기 그대로 근류를 넣고 살균액(0.1%, HgCl2)을 일간 용기의 최상부까지 가하여
용기내를 살균한다. 1∼2분 후 승홍수 1/3정도를
남겨놓고 버린 후 3∼4분간 살균한다. 그러나 아카시아 등의 수목의 근류는 표면이 강하고 크므로 살균시간을 5∼7분까지 연장하거나
물 1ℓ에 승홍 1g과 진한 염산 5 ㎖를 가해서 살균액으로 하여 4∼5분간 살균한다.
근류표면의 살균이 끝나면 승홍수를 별도의 용기에 따르고 살균수로 용기
내부와 근류표면에 승홍수가 남아 있지 않게 세척한다. 세척은 살균수를 가해 잘 진탕하여 세척하는 과정을 4∼6회
반복한다.
8.2.3 근류의 마쇄
근류가 작은 경우에는 살균에 사용된 용기를 그대로 이용하여 근류의
2∼3배의 살균수를 가하여 (1∼3㎖), 선단에 둥근 유리막대(3∼5mm두께)로 붉은색(leg - hemoglobin)이 나타날
때까지 마쇄한다. 한편, 근류가 크거나 단단한 경우에는 살균된 소형유침(내경 40∼50mm)을 이용하여 유봉으로
마쇄한다.
8.2.3 근류균의 분리
마쇄액을 일반 세균분리조작에 준하여 백금이를 이용하여 평판법으로 한다. 이
때 사용되는 배지는 yeast extract mannitol배지이다. 평판배지에 이식한 후 27∼28℃로 배양하여 콜로니를
형성시킨다. 콜로니는 생육이 빠른 것은 2∼3일, 늦는 것은 5∼6일경에 형성된다.
콜로니가 독립되어 나타나는 시기에 페트리접시 뒷면,콜로니 주위 및 내부의
성장을 저배율로 검경하며, 단세포에서 생육된 정상적인 독립콜로니를 yeast - extract mannitol 사면배지에
이식한다.사면배지에 이식한 후, 생육속도, 콜로니특징 등을 관찰, 기록한다. 콜로니가 비정상적일 때는 다시 한번 근류균부유액을
만들어 희석평판법 또는 이복평판법을 반복하여 완전한 순수균을 분리한다.
표 8 - 5 근류균 및 평판상의 콜로니의 일반적인 특성
식물군명 |
근 류 균 |
숙 주 식 물 |
콜 리 니 특 성 |
알팔파 |
R. meliloti |
Medicago
Melilotus |
원형, 백색 또는 무색투명∼반투명, 습윤한 파라핀상 이슬방울처럼
돌기, 생육 늦음 5∼6일 28℃ |
콜로바 |
R. trifolii |
Trifolium |
원형, 백색반투명, 이슬방울처럼 돌기, 점성(실처럼
늘어남), 생육 빠름(2일) |
완두 |
R. legumi nosarym |
Vicia
Pisum
Lathyrus |
원형, 백색반∼투명, 파라핀상 광택,
이슬모양돌기
점성이 크고 생육이 빠름(2일) |
강낭콩 |
R. phaseoli |
Phaseolus
Vulgaris |
완두, 클로바군과 흡사 |
루핀 |
R. lupini |
Lupinus
Ornithopus |
원형, 백색불투명, 약간 습성이며 파라핀상 광택
생육이 늦음(6∼7일) |
대두 |
R. japolicum |
Glycine |
루핀군과 유사한 균주와 반투명으로서 생육이 약간 빠른 균주가
있다. |
Cowpea |
R. sp. |
Arachis
Canavalia
Vigna
Lespedeza
Phaselus
Angularis |
루핀과 대두군과 흡사 |
자운영 |
R. sp. |
Astragalus
Sinicus |
원형, 대부분의 균주는 투명, 습성
물방울상, 생육은
3∼4일 |
8.2.4 근류균 확인 및 동정
순수분리된 균의 근류균여부는 근류를 채취한 식물을 공시접종하여
근류형성유무를 확인한다. 이 때 인공배지상에서 세균학적인 성상의 검색을 행한다.
8.3 질소고정력(아세틸렌 환원력)의
측정
Dilworth 등이 처음으로 미생물의
공중질소고정효소(nitrogenase)가 아세틸렌(C2H2)을
에틸렌(C2H4)으로 환원하는 작용이 있다는 것을 발표가 이래, 종래의
Kjeldahl법이나 중질소법보다 감도가 높은 아세틸렌 환원법으로 공중질소고정에 대한 연구를 진행하고 있다. 이 방법은 감도가
Kjeldahl법의 104배, 중질소법의 103배 높으며 간단, 신속히 측정할 수 있고
중질소법에 비해 경제적 이점이 있다. 그 반면에 이 방법은 간접측정법으로서 질소고정량을 정량적으로 측정하는 경우에는 공시 시료의
질소고정 효소계의 아세틸렌 환원법과 중질소법에서 측정된 질소고정량과의 정확한 비율을 알 필요가 있다. 이론으로는 다음 반응과
같으며 같은 양의 환원물질공급으로 3몰의 아세틸렌이 환원되는데 대하여 1몰의 질소분자가 환원되어 환산비의 이론치는
3:1(C2H2 - N2)이다.
3C2H2
+ 6H+
+ 6e- -----→
3C2H4
N2
+
6H+ + 6e-
-----→
2NH3
연구자에 따라 반응물질 대신에 생성물질 3몰의 에틸렌과 2몰의 암모니아의
비율을 사용하여 환산비의 이론치를 1.5:1(C2H4 - NH3)로
하여 이용하고 있다.
전자의 경우 환원된 아세틸렌과 생성된 에틸렌은 같은 양이므로 3:1의
비율은 실제 측정하는 에틸렌의 양과 질소분자와의 비율로서 이용해도 좋다. 아세틸렌은 인화폭발하기 쉬우므로 세심한 주의가 필요하며,
아세틸렌의 에틸렌으로의 환원작용이 질소고정 효소계 이외의 대사에 존재할 수 있다는 것이 이 방법의 불리한 점이기도
하다.
그러나 현재까지 이 반응이 질소고정 효소계 이외에서 검출된다는 보고가
없으므로 아세틸렌 환원법은 생물권의 질소고정 효소계의 검출 및 질소고정능의 측정에 좋은 방법이라고 생각하여도
좋다.
8.3.1 시료의 채취와 조제
토양을 시료로 하는 경우에는 자연상태로 채취하여 균일하게 혼합하여
10∼20g을 삼각플라스크 등에 넣고 측정하거나 그 밖의 시료에 대해서는 적합한 용기를 이용하여(가지달린 플라스크 혹은 시험관
등) 측정에 사용한다.
8.3.2 기상 조작
밭 토양시료는 보통 산소 20%, 탄산 가스 0.04%, 아세틸렌 10%와
아르곤 가스 69.96%의 가스조성으로 1기압으로 하여 배양한다. 아르곤 대신에 헬륨을 사용하기도 하지만 아르곤이 널리 사용되고
있다. 아르곤은 보통 가장 나중에 용기내부를 1기압으로 조절할 때 주입한다. 아세틸렌은 작은 배양용기를 사용할 때는 주사기를
사용하여 용기내부의 기상을 치환 주입한다.
물론 이러한 가스조성은 실험목적에 따라 다르며, 그 목적에 맞게 산소나
아르곤의 비율을 변화하는 것이 필요하다. 예를 들어, 혐기성 아세틸렌 환원능을 측정하는 경우에는 산소를 제거하고 그 양만큼
아르곤으로 치환된다. 근권토양이나 미생물일때는 산소농도가 기상의 수 % 이상이어야 아세틸렌 환원능이 최고가 된다는 보고도 있어,
시료에 관한 최적의 기상을 알 필요가 있다.
절소고정균의 아세틸렌의 포화농도는 0.025부터 0.1기압 사이에 있으므로
아세틸렌 환원능 측정에는 아세틸렌의 농도가 가상의 5∼10%가 되게 한다. 아세틸렌 가스는 고순도의 것이라 해도 acetone을
함유하는 것이 있으므로 진한 황산이 들어있는 가스흡입병에 통과시켜 사용한다. 한편 아세틸렌 가스통은 불순물로서 소량의 에틸렌을
함유하기도 하므로 반드시 같은 기상상태하에서 시료를 포함하지 않은 blank를 두어 그 에틸렌 양을 시료의 에틸렌 양에서 감한다.
또는 아세틸렌가스를 사용 전에 에틸렌 흡수제인 과염소산 수은 용액에 통과시켜 사용한다. 아세틸렌은 인화력이 강하므로 반드시 화기를
엄금시켜야 한다.
8.3.3 배양조작
배양온도는 목적에 따라 다르지만 25∼30℃에서 행한다. 조류나 광합성
세균의 아세틸렌 환원능을 측정할때는, 지상부의 광합성 작용에 따른 영향을 고려하여 지상부를 광조건하에서 배양할 필요가
있다.
배양시간은 10분 내지 수 분내에, 분리균이나 토양은 수 시간이내에 기상의
에틸렌 분석을 한다.
공시시료에 관해 경시적으로 아세틸렌 환원능을 측정하여 배양시간과 활성과의
사이에 직선적 상관관계가 있는지를 검토하고, 그 상관이 인정되어지는 시간내에 측정한다.
토양과 같은 자연의 복잡한 계의 아세틸렌 환원능을 측정하는 경우, 토양내의
수 많은 요인이 영향을 끼칠 가능성이 있으므로 세심한 주의가 필요하다. 토양시료의 아세틸렌 환원능 측정에서 일반적으로 5시간
동안은 배양시간과 아세틸렌 환원능간에 직선적인 상관관계가 있다고 보고되고 있다. 그러나 24시간 이상 배양할 때 비정상적인 높은
환원능이 측정되기도 하는데 이는 2차적인 요인에 의해 얻어지는 결과일 수도 있으므로 주의할 필요가
있다.
8.3.4 분석용 가스 채취
시료를 일정시간 배양한 후, 배양기내의 기상의 일부를
가스분석용주사기(gas tight syringe)로 채취한다. 정성분석에서는 임의의 양으로도 좋지만 정량분석에는 반드시 정확한
량을 채취하여야 한다. 채취량은 경우에 따라 조절할 수도 있지만 보통 가스 크로마토그래피에 의한 가스 분석 시 1회의 주입량을
0.1㎖내지 1㎖로, 1㎖ 정량의 주사기가 사용된다. 주사기를 오랜 시간 사용하면 가스누출이 생기므로 검사를 한 후 사용한다.
시료의 수가 많거나 그 외의 이유로 직접 분석할 수 없을 때에는 0.5
내지 1㎖의 50% trichloro acetic acid나 2㎖의 2.5M 황산 등을 주사기로 주입하여 반응을 정지시키기도
한다. 이 때는 반드시 시약과 시료간에 화학적으로 에틸렌의 생성유무를 미리 확인할 필요가
있다.
8.3.5 가스 크로마토그래피의 조건
아세틸렌 환원법에는 반응생성물인 에틸렌을 가스크로마토그래피로 분석하는 것이
보통이다. Column으로 특별히 정해진 것은 없지만 일반적으로 유리관 및 스테인레스관 등을 사용한다. Column 길이는
1.83m, 직경이 3.2mm 인 것이 가장 편리하다. Column 충진제(packing material) 또는
고정상(stationary phase)으로는 porapak R이 가장 많이 사용된다. 새로이 조제하여 충진된 Column은 사용
전에 충진제 사용한계 이하의 온도에서 수 시간 이상 Carrier gas를 유입시키며 가열한 후 사용한다. Carrier
gas로는 질소, 헬륨가스가 일반적으로 사용된다.
Column온도는 porapak의 경우 보통 50℃ 전후에서
사용한다.
검출기(Detector)는 수소 이온화 측정기(hydrogen
ionization detector)이며, 검출기 온도 및 시료주입구(injector)의 온도는 Column 온도보다 약간 높은
것(80℃)이 보통이다. 이상의 조건으로 가스를 주입하면 수 분 이내에 아세틸렌과 에틸렌의 분리된 peak가 나타나게
된다.
8.3.6 에틸렌의 검량
여러 농도의 표준 에틸렌 가스를 조제하여 일정량을 가스크로마토그래피에
주입한 후 나타난 peak 높이를 측정하여 표준 검량선을 작성한다. 가스정량은 그 때의 대기압과 온도에 따라 변하므로 반드시
분석시의 대기압과 온도를 정확히 기록한다. 대기압은 기압계의 수은주 높이(mm), 기온은 한난계(℃)로 읽으며 에틸렌 가스
1ℓ중의 몰수를 계산한다.
이 식은 P는 압력으로 수은주 높이(mm)이고 T는 절대온도로 온도(℃)
+ 273으로 표시한다. 예로서 대기압이 750 mmHg이며 온도가 30℃일때 1ℓ의 에틸렌 가스는 0.03969 M로서
1㎖(cc)에는 0.03969 mM, 1㎕에는 0.03969 μM을 함유하고 있다.
8.3.7 질소고정량으로의
환산
공중질소고정효소는 이론적으로 3몰의 아세틸렌을 에틸렌으로 환원할 때
질소가스 1몰이 환원되어 암모니아가 된다. 이론치 3 : 1(C2H2 :
N2)를 공시시료의 공중질소고정효소계에 적용할 때 토양 1g이 하루에 1.5 nanoM의 아세틸렌을 에틸렌으로
환원된다면 1년간 1ha당 고정되는 량은
![]()
1몰의 질소분자량은 28이고, nano mole일 경우 109으로 나눌
필요가 있다. 1ha의 토양중량이 2 Ⅹ 109g, 일년은 365일로서 위와 같이 10.22kg의 질소가 1ha의 밭에서
고정된다.
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