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산업기반기술개발사업 보고서 초록
관리번호 |
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과제명 |
고속액체크로마토그래프 분석기의 성능평가 방법 개발 |
키워드 |
자외선·가시광선 검출기/굴절률 검출기/용매이송펌프/컬럼온도제어계 |
개발목표 및 내용 | |
1. 최종 개발목표 “고속액체크로마토그래프 분석기의 성능평가 방법 개발” 가. 용매이송펌프의 평가항목 설정 및 시험평가 방법 개발 나. 자외선·가시광선 검출기의 평가항목 설정 및 시험평가 방법 개발 다. 굴절률 검출기의 평가항목 설정 및 시험평가 방법 개발 라. 컬럼온도제어계의 평가항목 설정 및 시험평가 방법 개말 2. 당해연도 개발내용 및 결과 가. 용매이송펌프의 평가항목 설정 및 시험평가 방법 개발 ⑴ 유속 정확도 및 정밀도 ⑵ 최대 사용 압력 ⑶ 시스템 부피 나. 자외선·가시광선 검출기의 평가항목 설정 및 시험평가 방법 개발 ⑴ 파장 정확도 및 정밀도 ⑵ 잡음 수준 ⑶ 표류 ⑷ 직선범위 및 최소 검출량 다. 굴절률 검출기의 평가항목 설정 및 시험평가 방법 개발 ⑴ 잡음 수준 ⑵ 표류 ⑶ 직선범위 및 최소 검출량 라. 컬럼온도제어계의 평가항목 설정 및 시험평가 방법 개발 ⑴ 온도 설정 정확도 ⑵ 온도 제어 정밀도 3. 기대효과(기술적 및 경제적 효과) 표준규격 가이드라인을 제정하여 국산 분석기기 생산업체의 신제품 개발에 가이드라인을 제시하여 동규격에 따라 제품을 생산하고 소비자도 제품평가 시 동규격을 판단의 객관적인 자료로 활용하도록 함. 국내 분석기기 시장에서 국산 분석장비에 대한 소비자의 인식을 제고하여 동 산업의 활성화를 유도함으로써 장기적으로는 수입대체 효과와 전 세계시장의 판매를 통한 외화 획득에 일조함. 4. 적용분야 화학, 식품, 의학, 약학, 생물화학, 농약 유기물 제조 및 분석분야, 환경과학 등 모든 과학 분야의 분리·분석 및 정량에 적용 |
제 1절. 용매이송펌프 성능평가
1. 배경
다음은 용매이송펌프의 성능평가를 위한 평가항목 및 시험방법이다.
1.1 용어 정의
- 다음의 용어는 KS M 0124(분석 화학 용어-분석기기 부문), KS M 0126(분석 화학 용어-기초 부문)에 따른다.
용어 |
정의 |
정확도 |
참값으로부터 편중된 정도 |
정밀도 |
측정치에서 분산의 정도 |
측정값 |
측정에 의해 얻어지는 값 |
편차 (deviation) |
측정치로부터 그 기대치(통상은 평균치)를 뺀 값 |
참값 |
측정치의 바른 값 |
용출액 |
액체 크로마토그래피에서 용리액에 의해 전개되었을 때 컬럼으로부터 유출되는 액체 |
용매 |
용액에서 물질을 녹이기 위해 사용되는 액체 |
90% 응답 시간 |
연속 측정식의 연속 분석계에 의한 계측에서 측정 대상의 농도를 영에서부터 고농도로 바꾸었을 때 또는 반대로 하였을 때, 분석계의 지시가 전환 시간으로부터 최종값의 90%에 상당하는 점에 도달하는데 필요로 하는 시간. T90으로 표시한다. ⇒ 응답이 느린 분석계에서는 상승점의 판단이 어렵다. 외국에서는 10% 상당점에서 90% 상당점까지의 시간을 말하는 수가 있다. |
1. 2. 평가항목
- 유속 정확도
- 유속 정밀도
- 최대 사용 압력
- 압력 표시 정확도
- 시스템 부피
- 기울기 용리 추적도 (프로파일)
1. 3. 고려사항
- 역압장비나 작은 내경의 튜빙코일을 사용하여 최소한 500psi의 압력을 유지함.
- 물에서는 미생물이 번식할 수도 있으므로 이동상으로 HPLC 등급의 메탄올을 사용함.
- 254nm에서의 검출을 위해 메틸파라벤이나 아세톤과 같은 UV 흡광 물질을 사용함.
2. 성능평가 시험 방법
2. 1 유속 정확도 (Accuracy of flow rate)
2.1.1 표시 방법
± O mL/min
2.1.2 정의
표시 유속과 실제 유속과의 차이
2.1.3 시험 방법
- 최소한 2개의 다른 유속을 설정하여 측정해야 함
- 최소 5.0mL/min의 용출액을 받음
- 각 유속에 대하여 5회 반복 측정함
- 메스플라스크는 검교정 받은 것으로 20℃에서 0.2% 이상의 정확도를 갖는 장치를 사용함
(1) 일정 사용 압력 하에서 펌프의 유속을 1.0mL/min으로 설정한 후 메스플라스크의 눈금까지 용출액을 받는다.
(2) 10ml의 용출액을 받는데 걸리는 시간을 초시계로 측정하여 기록한다.
2.1.4 데이터 처리
- 한 측정 조건 하에서 평균값을 구하여 표시 유속과의 편차를 구함
- 유속은 다음 식을 이용하여 계산함
F=V/t
F : 유속
V : 모아진 용출액의 부피
t : 용출액을 받는데 소요된 시간
2.1.5 오차의 허용 범위
허용되는 오차 범위는 표시 유량의 ± 5% 이내이다. (JIS 규격 참조)
측정된 유속이 유속 정확도 범위에 들지 않는다면 기기의 Flow calib. 값을
조절하여야 한다.
2. 2 유속 정밀도 (Precision of flow rate)
2.2.1 표시 방법
± O mL/min
2.2.2 정의
일정 압력 하에서의 유속 변동폭
2.2.3 시험 방법
- 측정 사이에 수집 용기를 철저히 건조해야 함
- 메스플라스크는 검교정 받은 것으로 20℃에서 0.2% 이상의 정확도를 갖는 기기를 사용함
(1) 일정 사용 압력 하에서 펌프의 유속을 1.0ml/min으로 설정한 후 10ml 메스플라스크의 눈금까지 용출액을 받는다.
(2) 10ml의 용출액을 받는데 걸리는 시간을 기록한다.
(3) 위 과정을 5회 반복하여 측정한다.
2.2.4 데이터 처리
유속 정밀도는 다음의 방정식으로부터 유속의 상대 표준 편차 (RSD)를 계산하여 결정한다.
Fi : 개별 유속 값
Faver : 평균 유속 값
n : 유속 측정 횟수
2.2.5 오차의 허용 범위
정밀도에서 허용되는 오차 범위는 RSD=1% 이내이다.
2. 3 사용 압력 (Maximum operating pressure)
2.3.1 표시 방법
O psi
2.3.2 정의
해당 장치가 성능을 발휘할 수 있는 액송 펌프의 최대 배출 압력
2.3.3 시험 방법
(1) 펌프가 성능을 발휘할 수 있는 상태의 최대 압력으로 유량을 설정한다.
(2) 일정 사용 압력 하에서 10ml 메스플라스크의 눈금까지 용출액을 받는다.
(3) 10ml의 용출액을 받는 시간을 기록한다.
(4) 측정한 유속이 유속 정확도에 부합되는지를 확인한다.
2.3.4 데이터 처리
최대 사용 압력에서 측정한 유속이 오차 범위 5%의 유속 정확도에 부합되는지를 확인한다.
2. 4압력 표시 정확도 (Accuracy of pressure display)
2.4.1 표시 방법
O %
2.4.2 정의
표시 압력과 실제 압력의 차
2.4.3 시험 방법
- 교정 압력계는 psi의 표시를 위해 단위를 교환해서 표시하는 것을 사용함
(1) 용매를 흘려주어 펌프에 압력을 건다.
(2) 펌프에 표시된 압력과 교정 압력계에 나타난 실제 압력을 기록한다.
(3) 표시 압력과 실제 압력의 차를 읽는다.
2.4.4 오차의 허용 범위
압력 표시 정확도에서 허용되는 오차 범위는 10% 이내이다. (Waters validation 참조)
2. 5 시스템 부피 (Volume of system)
2.5.1 표시 방법
O mL
2.5.2 정의
지연부피와 유효혼합부피의 총 합
- 지연 부피 : 펌프와 주입구 사이의 부피(V1) 및 주입구와 검출기 사이의
부피(V2)
- 유효혼합부피 : 구배(gradient)용매 혼합 장비의 부피
그림 2-1 Gradient Pump 평가를 위한 구조 개요
2.5.3 시험 방법
- 1-2ml/min 범위에서 일정한 유속을 유지함
- 3회 반복 측정함
가. 용매의 준비
- 용매 A와 B를 준비함
A : HPLC 등급 메탄올
B : 0.05mg/ml 메틸파라벤 혹은 0.3%(v/v) 아세톤이 포함된 용매
- 각 용매의 기체를 제거하고 용매 라인을 퍼지함
- B 용매 100%를 흘렸을 때 검출기의 선형 범위를 넘을 경우 용매를 추가하여 B 용매를 희석함
나. 총지연 부피 및 유효혼합부피 측정
(1) 일정 사용 압력 하에서 유속을 1.0ml/min으로 한다.
(2) A 용매 100%를 등속으로 하여 안정된 바탕선을 얻는다.
(3) B 용매 20ul를 주입하고 주입 즉시 B 용매 100%를 일정한 풀 스케일의 응답이 얻어질 때까지 흘린다.
(4) 약 5-10분 정도가 지나면 다시 A 용매를 100%로 흘린다.
2.5.4 데이터 처리
가. 총지연 부피
- 총지연 부피는 펌프와 주입구 사이의 부피(V1)와 주입구와 검출기 사이의 부피(V2)로 나누어지며 다음 공식을 이용하여 계산함
V1=(td-ti)ⅹF
V2=(ti-t0)ⅹF
VT=V1+V2=(td-t0)ⅹF
t0 : 순서의 주입과 시작점
ti : 순서의 시작과 주입된 시료 피크의 용출 사이의 시간
td : 순서의 시작과 처음 단계 기울기 용리 동안 바탕선과 외삽직선의 교차점 사이의 시간
F : 유속 (ml/min)
나. 유효혼합부피
Vm=(t90-td)ⅹF/2.302
Vm : 유효혼합부피
t90 : B 용매에 대해 총응답의 90%에 응답이 도달할 때의 시간
td : 총 지연 시간
F : 유속 (ml/min)
2.302=ln10
td 근처의 지역이 최초의 혼합이 일어나는 기울기 용리 부분이다. 이상적으로는 반듯한 각도로 직선 계단의 도입 부분에서 분명한 변형이 관측되어야 한다. 그러나 일부 혼합 시스템의 고유 설계상 바로 변화의 전송이 일어나지 않으며 곡률이 발견되기도 한다. 이 곡률은 유효혼합부피에 종속적이다. 정확한 성능을 위해서는 이 부피가 최소화되어야 한다.
2.5.5 오차의 허용 범위
총지연 부피의 경우에는 0.5~5.0ml, 유효혼합부피의 경우에는 0.2~2.5ml의 범위에 들어야 한다.
그림 2-2 시스템 부피 측정 gradient profile
2. 6. 기울기 용리 추적도 (Gradient profile)
2.6.1 표시 방법
O %
2.6.2 정의
기울기 용리 과정에서의 직선 및 단계 기울기 용리를 통해 얻어지는 상대 응답 정도
2.6.3 시험 방법
- 1-2ml/min 범위에서 일정한 유속을 유지함
- 3회 반복 측정함
가. 용매의 준비
- 용매 A와 B를 준비함
A : HPLC 등급 메탄올
B : 0.05mg/ml 메틸파라벤 혹은 0.3%(v/v) 아세톤이 포함된 용매
- 각 용매의 기체를 제거하고 용매 라인을 퍼지함
- B 용매 100%를 흘렸을 때 검출기의 선형 범위를 넘을 경우 용매를 추가
하여 B 용매를 희석함
나. 직선 및 단계 기울기 용리
- 단계 기울기 용리 과정에서는 추가 지점에서 원하는 대로 시험할 수
있음
- 3회 이상 측정함
- 펌프를 프로그램하여 1-2ml/min 범위의 일정 유속에서 아래 순서로 용매
가 섞이도록 송액함
(1) A 용매를 100%로 등속한다.
(2) B 용매 100%로 20-50분 정도 범위에서 선형 기울기 용리를 한다.
(3) B 용매를 100%로 등속하여 5-10분 정도 안정된 풀 스케일 응답을 얻는다.
(4) B 용매를 80%, 60%, 40%, 20%로 등속 혼합하여 각각 5-10분 정도 유지한
후 A 용매로 돌아가서 안정한 바탕선을 얻는다.
그림 2-3 유속 변화gradient profile
2.6.4 데이터 처리
가. 직선 범위
(1) 자를 연속적인 단계 기울기 용리 전에 나타난 직선 부위에 놓아 직선으로부터 ±1%의 편차 지점을 관측한다.
(2) 관측한 ±1%의 편차 지점 범위에 직선이 포함되는지 확인한다.
직선성은 O%에서 O%까지의 범위로 표현되며 이는 A 용매를 0%로 B 용매를100%로 정의할 때 한한다. 이상적인 기울기 용리 시스템은 0%에서 100%까지 전 범위에서 직선이어야 한다. 하지만 선형 계단의 시작점 및 끝점 근처의 곡률 부분은 이상적인 경우와 편차가 있을 수 있다. 다시 말해서 정확한 성능을 위해선 이 곡률이 최소화 되어야 한다.
그림 2-4직선 gradient profile
나. 혼합 섞임의 정확도
이는 연속적인 단계 기울기 용리로부터 결정되며 각 단계에 대한 상대 응답은 다음 공식을 이용하여 계산함
% cal=Ri/R100ⅹ100%
% calc : 최대 응답 계산의 퍼센트
Ri : 각 개개(20, 40, 60, 80 등)의 단계에 대한 UV 응답
R100 : B 용매 100%에 대한 UV 응답
그림 2-5 단계 gradient profile
다. 기울기 용리 혼합 시스템의 정밀도
이는 직선 기울기 용리나 연속적인 단계 기울기 용리를 사용하여 얻어짐
(1) 직선 기울기 용리의 정밀도
(가) 최대 응답의 1%의 수직 직선거리 2개를 평행이 되도록 그린다.
(나) 실제 UV 추적이 전 직선성 범위에서 ±1% 제한 범위 안에 있는지 확인한다.
라. 단계 기울기 용리의 정밀도
상대 표준 편차 공식을 이용해 계산한다.
마. 기울기 혼합 시스템의 반복성
(1)같은 용매를 가지고 여러 번 동작시켜 결과를 얻는다.
(2)최소 UV 신호(A 용매 100%), 최대 UV 신호(B 용매 100%), 곡률, 직선성 범위, 정확도, 정밀도 등의 항목을 비교한다.
2.6.5 오차의 허용 범위
가. 직선 범위
직선으로부터 ±1%의 편차 지점에 직선이 포함되어야 한다.
나. 혼합 섞임의 정확도
오차 범위가 ±1%의 정확도에 들어야 한다.
다. 기울기 용리 혼합 시스템의 정밀도
(1) 직선 기울기 용리의 정밀도
전 직선 부분에 걸쳐 ±1% 이내의 편차에 들어야 한다.
(2) 단계 기울기 용리의 정밀도
1% 미만의 표준편차를 가져야 한다.
(3) 기울기 혼합 시스템의 반복성
비교 항목들이 ±1%의 편차 범위에 들어야 한다.
직선 범위, 혼합 섞임의 정확도, 기울기 용리 혼합 시스템의 정밀도(선형 기울기 용리의 정밀도, 단계 기울기 용리의 정밀도), 기울기 혼합 시스템의 반복성의 경우 간단히 겹쳐보는 것만으로도 확인할 수 있다.
제 2절. 자외선·가시광선 검출기 성능평가
1. 배경
다음은 자외선·가시광선 검출기의 성능평가를 위한 평가 항목 및 시험방법이다.
1.1 용어 정의
다음의 용어 정의는 KS M0124(분석 화학 용어-분석기기 부문), KS M0126(분석화학 용어-기초 부문)을 참고하였다.
용어 |
정의 |
흡광도 |
물질이 빛을 흡수하는 정도로서 투광도의 역수를 상용대수로 나타낸 수치 |
투광도 |
빛이 물질을 투과하는 비율을 투과 후의 광량과 투과 전 광량의 비로 나타낸 것 |
영점 조정 |
투과 백분율 눈금 지시계의 지시를 영의 눈금에 조정하는 조작 |
측정값 |
측정에 의해 얻어지는 값 |
표류 (drift) |
일정한 환경 조건 하에서 측정량 이외의 영향에 의해 생긴 계측기 표시의 느슨함으로 생기는 계속적인 착오 |
편차 (bias) |
측정치 또는 평균치로부터 참값을 뺀 값 |
평균값 |
서로 더하여 평균한 값 |
참값 |
측정치의 바른 값 |
시료 용액 (sample solution) |
시료를 용액으로 한 것 또는 분석용으로 채취한 용액 |
원액 (stock solution) |
(1) 사용할 때마다 진하게 조제하며 보존의 목적을 겸한 시약 용액 (2) 분취하여 분석하기 위한 시료 용액 |
용리액 |
칼럼에 유지되어 있는 시료 성분을 전개, 용출시키기 위하여 사용하는 액체 |
1.2 평가 항목
- 파장 정확도
- 파장설정 정밀도
- 잡음수준
- 표류
- 직선 범위
- 최소 검출량
2. 성능평가 시험방법
2. 1파장 정확도 (Wavelength accuracy)
2.1.1 표시 방법
+ O.O nm 혹은 - O.O nm
2.1.2 정의
알려져 있는 시료 물질의 최대 흡수파장과 실제 측정한 최대 흡수파장의 편차
2.1.3 시험 방법
2.1.3.1 시료 주입식으로 측정하는 경우
가. 시료 용액의 제조
(1) 100ppm의 naphthalene/methanol 용액을 제조한다.
(2) 시료 용액 제조 후 유기 물질을 거르기에 알맞은 0.45㎛ filter로 용액을 걸러 입자가 남아있지 않도록 한다.
메탄올에 나프탈렌을 녹인 시료 용액 대신 0.14M erbium perchlorate 수용액과 0.14M holmium perchlorate/methanol 용액도 가능함.
나. 시험 조건
(1) 시료 용액의 최대 흡수 파장
(가) naphthalene/methanol : 219nm
(나) erbium perchlorate 수용액 : 255nm
(다) holmium perchlorate/methanol : 241nm, 362nm, 536~537nm
(2) 검출기를 켜고 설명서에 따라 기기를 예열시킴
(3) 검출기에 시료 용액 제조 시 사용한 메탄올을 충분히 흘려주어 바탕선 이 안정되면 최대 흡수파장을 중심으로 –5nm에서 +5nm 정도를 측정 파장 범위로 선택한 후 1.0nm 간격으로 다음 과정을 반복함
(4) Erbium perchlorate의 경우에는 용리액으로 초순수의 증류수를 사용하고 holmium perchlorate의 경우에는 용리액으로 메탄올을 사용함
다. 파장에 따른 흡광도 측정
(1) 시료 용액 50㎕를 시료 주입구를 통해 주입하고 얻어진 데이터를 통해 흡광도를 기록한다.
(2) 파장을 1nm 올리고 영점 조정을 한다.
(3) 시료 용액 50㎕를 주입구를 통해 주입하고 얻어진 데이터를 통해 흡광도를 기록한다.
2.1.3.2 시료 주입식이 아닌 경우 (scan 기능을 사용하는 경우)
가. 시료 용액의 제조
(1) 용매로 사용하는 메탄올은 HPLC 등급을 사용함
(2) 제조된 용액의 농도가 진한 경우에는 추가로 메탄올을 첨가하여
희석함
(3) 5ppm 나프탈렌/메탄올 용액을 제조함
나. 시험 조건
(1) 측정 파장 범위는 최대 흡수파장을 기준으로 최소 -5nm에서 +5nm 구
간을 설정함
(2) 시료 셀에 용액을 흘려줄 때는 주사기나 펌프를 사용하는데 기포가
생기지 않도록 특히 유의함
(3) 펌프를 사용하는 경우에는 흡광도 측정 시 펌프를 멈춘 정지 상태에서
측정해야 함
다. 파장에 따른 흡광도 측정
(1) 검출기를 켜고 설명서에 따라 기기를 예열시킨다.
(2) 검출기에 시료 용액 제조 시 사용한 메탄올을 충분히 흘려주어 출력값이 안정되면 메탄올로 blank 스캔을 한다.
(3) 5ppm 나프탈렌/메탄올 용액을 충분히 흘려주어 출력값이 안정되면 시료를 스캔한다.
(4) 얻어진 데이터를 통해 흡광도를 기록한다.
2.1.4 데이터 처리
(1) 파장에 따른 흡광도 변화를 도시하고 최대 흡광도가 나타나는 파장을 결정한다.
(2) 이 최대 흡광도가 나타난 파장을 나프탈렌의 최대 흡수 파장인 219nm와
비교한다.
(3) 시험용 시료의 최대 흡수 파장값과 측정 파장값을 기록한 후 편차(bias)를 구한다.
(4) 측정된 최대 흡수 파장값은 제조 업체의 파장 정확성 설명서에 부합되어야 하며 만약 검출기가 설명서에 맞지 않는다면 램프나 단색화 장치를 재조정해야 한다.
2.1.5 오차의 허용 범위
허용되는 오차 범위는 자외선 영역에서는 ±1nm, 가시광선 영역에서는
±3nm이다. (유럽 약전(EP : European Pharmacopoeia)에 기초)
2. 2. 파장 설정 정밀도 (Precision of wavelength setting)
2.2.1 표시 방법
± O.O nm
2.2.2 정의
기기를 다시 조정하거나 파장을 변화시킨 후에도 알려져 있는 시험물질의 파장의 흡수띠를 처음 측정했을 때와 같은 스펙트럼 위치값을 나타내는 반복성
2.2.3 시험 방법
2.2.3.1 시료 주입식으로 측정하는 경우
가. 시료 용액의 제조
파장 정확도 측정한 100ppm 나프탈렌/메탄올 용액 사용.
erbium perchlorate 수용액(255nm)과holmium perchlorate/methanol 용액
(: 241nm, 362nm, 536~537nm)도 가능함.
나. 흡광도 측정
시험 시료 성분의 최대 흡수파장에서 파장을 재설정한 후에 시료 용액의 흡광도를 반복 측정함
(1) 시험 시료의 최대 파장 (나프탈렌 : 219nm)으로 검출기를 설정한다.
(2) 바탕선이 안정해질 때까지 시험 용액 제조 시 사용한 메탄올을 충분히 흘려주고 검출기를 영점 조정한다.
(3) 시료 용액을 주입한다.
(4) 흡광도를 기록한다.
(5) 최대 흡수파장에서 적어도 10nm를 움직인 후 검출기 파장을 최대 파장으로 다시 설정하고 시료 용액을 주입하여 흡광도를 기록한다.
(6) 위 과정을 5회 반복하여 5번의 흡광도 측정값을 얻는다.
2.2.3.2시료 주입식이 아닌 경우 (scan 기능을 사용하는 경우)
가. 시료 용액의 제조
- 파장 정확도 측정한 100ppm 나프탈렌/메탄올 용액 사용.
- erbium perchlorate 수용액(255nm)과holmium perchlorate/methanol 용액
(: 241nm, 362nm, 536~537nm)도 가능함.
나. 흡광도 측정
- 측정 파장 범위는 최대 흡수파장을 기준으로 최소 -5nm에서 +5nm 구간을 설정함.
- 시료 셀에 용액을 흘려줄 때는 주사기나 펌프를 사용하는데 기포가 생기지 않도록 특히 유의함.
- 펌프를 사용하는 경우에는 흡광도 측정 시 펌프를 멈춘 정지 상태에서 측정해야 함
(1) 검출기를 켜고 설명서에 따라 기기를 예열시킨다.
(2) 검출기에 시험용 용액 제조 시 사용한 메탄올을 충분히 흘려주어 출력값이 안정되면 메탄올로 blank 스캔을 한다.
(3) 5ppm 나프탈렌/메탄올 용액을 충분히 흘려주어 출력값이 안정되면 시료를 스캔한다.
(4) 위 과정을 5회 반복한다.
2.2.4데이터 처리
- 검출 파장 범위 중 최대 흡수파장과 임의의 두 파장을 선택하여 RSD를 구함
파장 정밀도는 다음의 방정식으로부터 흡광도 기록의 상대 표준 편차(RSD)를
계산하여 결정한다.
Ai = 개별 흡광도 값
Aaver = 평균 흡광도 값
n = 흡광도 측정 횟수
2.2.5 오차의 허용 범위
정밀도에서 허용되는 오차 범위는 주입식 측정 방법을 사용한 경우 RSD=1%, 스캔 기능을 사용한 경우 RSD=0.1% 이내이다.
2. 3. 잡음 수준 (Noise level) : 정적 잡음, 동적 잡음
2.3.1 표시 방법
O AU (흡광도 단위)
2.3.2 정의
- 단시간 잡음 (Short-term noise)
분당 하나 혹은 그 이상 주기의 주파수를 가진 검출기 신호의 무작위적인 변이도에 대한 흡광도에서 피크와 피크 사이의 평균 진폭
- 장시간 잡음 (Long-term noise)
시간 당 6에서 60 주기(분당 0.1에서 1.0 주기)의 주파수를 갖는 검출기 신호의 무작위적인 변이도에 대한 흡광도에서 피크와 피크 사이의 최고 진폭
2.3.3시험 방법
- 시료 셀에는 HPLC 용 메탄올로 채우고 참조 셀에는 공기나 질소로 채움
- 높은 전압이 사용되는 경우는 셀 내의 공기에서 오존이 발생할 수 있는데 이것은 치명적인 표류를 일으킬 수 있으므로 공기보다는 질소를 사용하는 것이 바람직함
- 검출기를 시험 장소에 위치시키고 시험 시작 전 최소 24시간 정도 돌려줌
정적 상태 – 흐름이 없는 조건 하에서의 실험
동적 상태 – 1.0ml/min의 유속으로 흘려주는 조건 하에서의 실험
가. 정적 잡음 (static noise)
(1) 메탄올을 1.0ml/min의 유속으로 흐르게 하고 펌프와 검출기 사이의 압력을 최소로 걸어준다.
(2) 스테인레스 스틸 튜브를 검출기의 배출구에 연결하여 기포가 생기지 않도록 한다.
(3) 적당한 검출기 출력 단자에 기록계를 연결한다.
(4) 시스템 내부의 용매나 시료 잔류 물질, 기포 등을 제거하고 검출기, 용매 용기 및 크로마토그래프 시스템을 완전히 깨끗하게 하기 위하여 메탄올로
용기를 채우고 최소 30분 동안 펌프를 가동하여 용매를 흘려준다.
(5) 기준 셀 내부는 공기나 질소로 채워준다.
(6) 정적 시험을 위해서 펌프를 멈추고 시험 용매의 흐름없이 상온에서 최소 1시간 동안 크로마토그래프 시스템을 안정화시킨다.
(7) 최대 민감도(가장 낮은 감쇠율)로 감쇠기를 설정(흡광도 전눈금(AUFS) 범위의 가장 작은 값으로 설정)하고, 가변 감응시간을 가진 검출기의 경우 감응 시간을 조정해준다.
(8) 시험 장소의 주위 온도가 2℃ 이상 변화하지 않는 조건 하에서 적어도 1시간 동안 검출기 신호를 기록한다.
나. 동적 잡음 (Dynamic noise)
(1) 메탄올을 1.0mL/min의 유속으로 흐르게 하고 펌프와 검출기 사이의 압력을 최소로 걸어준다.
(2) 스테인레스 스틸 튜브를 검출기의 배출구에 연결하여 기포가 생기지 않도록 한다.
(3) 적당한 검출기 출력 단자에 기록계를 연결한다.
(4) 시스템 내부의 용매나 시료 잔류 물질, 기포 등을 제거하고 검출기, 용매 용기 및 크로마토그래프 시스템을 완전히 깨끗하게 하기 위하여 메탄올로 용기를 채우고 최소 30분 동안 펌프를 가동하여 용매를 흘려준다.
(5) 기준 셀 내부는 공기나 질소로 채워준다.
(6) 상온에서 15분 동안 크로마토그래프 시스템을 안정화시킨다.
(7) 시험 장소의 주위 온도가 2℃ 이상 변화하지 않는 조건 하에서 적어도 1시간 동안 검출기 신호를 기록한다.
2.3.4 데이터 처리
2.3.4.1정적 잡음
가. 정적 단시간 잡음
- 0.5에서 1분 사이의 간격으로 평행한 두 선을 그려 15분 동안 모든 관찰된 모든 변수의 기울기를 구함
(1) 두 선 사이의 거리를 최소화하기 위한 평행선을 그린다.
(2) 수직 거리를 재는데 이 두 선 사이가 AU이다.
(3) 모든 간격에 대한 평균값을 계산하는데 이 값을 셀 길이(cm)로 나눈다.
그림 2-6 Short-Term Noise 측정
나. 정적 장시간 잡음
- 15분 정도 정적 단시간 잡음을 측정하여 각 간격의 중앙을 표시함
(1) 10분 단위로 각 선들의 중앙점을 이어 평행선을 연속으로 그린다.
(2) 두 선 사이의 수직 거리(AU)가 가장 큰 평행선을 선택한다.
(3) 이 값을 셀 길이(cm)로 나눈다.
그림 2-7 Long-Term Noise 측정
2.3.4.2 동적 잡음
가. 동적 단시간 잡음 (그림 2-6 참조)
- 0.5에서 1분 사이의 간격으로 평행한 두 선을 그려 15분 동안 모든 관찰된 모든 변수의 기울기를 구함
(1) 두 선 사이의 거리를 최소화하기 위한 평행선을 그린다.
(2) 수직 거리를 재는데 이 두 선 사이가 AU이다.
(3) 모든 간격에 대한 평균값을 계산하는데 이 값을 셀 길이(cm)로 나눈다.
나. 동적 장시간 잡음 (그림 2-7 참조)
- 15분 정도 동적 단시간 잡음을 측정하여 각 간격의 중앙을 표시함
(1) 10분 단위로 각각의 선들의 중앙점을 이어 평행선을 연속으로 그린다.
(2) 두 선 사이의 수직 거리(AU)가 가장 큰 평행선을 선택한다.
(3) 이 값을 셀 길이(cm)로 나눈다
2. 4. 표류 (Drift)
2.4.1 표시 방법
O AU/h
2.4.2 정의
일정한 조건 하에서 측정값 이외의 영향에 의해 바탕선이 변동하는 것으로 그 정도를 AU/h로 표시한 것
2.4.3 시험 방법
가. 정적 표류
(1) 메탄올을 1.0mL/min의 유속으로 흐르게 하고 펌프와 검출기 사이의 압력을 최소로 걸어준다.
(2) 스테인레스 스틸 튜브를 검출기의 배출구에 연결하여 기포가 생기지 않도록 한다.
(3) 적당한 검출기 출력 단자에 기록계를 연결한다.
(4) 시스템 내부의 용매나 시료 잔류 물질, 기포 등을 제거하고 검출기, 용매 용기 및 크로마토그래프 시스템을 완전히 깨끗하게 하기 위하여 메탄올로 용기를 채우고 최소 30분 동안 펌프를 가동하여 용매를 흘려준다.
(5) 기준 셀 내부는 공기나 질소로 채워준다.
(6) 정적 시험을 위해서 펌프를 멈추고 시험 용매의 흐름없이 상온에서 최소 1시간 동안 크로마토그래프 시스템을 안정화시킨다.
(7) 최대 민감도(가장 낮은 감쇠율)로 감쇠기를 설정(흡광도 전눈금(AUFS) 범위의 가장 작은 값으로 설정)하고, 가변 감응시간을 가진 검출기의 경우 감응 시간을 조정해준다.
(8) 시험 장소의 주위 온도가 2℃ 이상 변화하지 않는 조건 하에서 적어도 1시간 동안 검출기 신호를 기록한다.
나. 동적 표류
(1) 메탄올을 1.0ml/min의 유속으로 흐르게 하고 펌프와 검출기 사이의 압력을 최소로 걸어준다.
(2) 스테인레스 스틸 튜브를 검출기의 배출구에 연결하여 기포가 생기지 않도록 한다.
(3) 적당한 검출기 출력 단자에 기록계를 연결한다.
(4) 시스템 내부의 용매나 시료 잔류 물질, 기포 등을 제거하고 검출기, 용매 용기 및 크로마토그래프 시스템을 완전히 깨끗하게 하기 위하여 메탄올로 용기를 채우고 최소 30분 동안 펌프를 가동하여 용매를 흘려준다.
(5) 기준 셀 내부는 공기나 질소로 채워준다.
(6) 상온에서 15분 동안 크로마토그래프 시스템을 안정화시킨다.
(7) 시험 장소의 주위 온도가 2℃ 이상 변화하지 않는 조건 하에서 적어도 1시간 동안 검출기 신호를 기록한다
2.4.4 데이터 처리
가. 정적 표류
1시간 동안 측정한 검출기 신호의 수직 거리를 최소화하는 평행선쌍을
그려 평행선의 기울기를 구한다.
나. 동적 표류
1시간 동안 측정한 검출기 신호의 수직 거리를 최소화하는 평행선쌍을그려 평행선의 기울기를 구한다.
그림 2-8 Drift 측정 방법
2. 5. 직선 범위 (Linear range)
2.5.1 표시 방법
O
혹은
O ㎍/mL – O ㎍/mL(단, 이러한 경우에는 시험 용액과 측정 파장을 명시)
2.5.2정의
직선성 그래프에서 ±5% 이내의 일정한 검출기 감응비를 나타내는 시료 물질의 농도 범위
혹은
시험 용매에 대한 시험 물질의 직선 범위에서 나타나는 상한선과 하한선의 농도 비.
2.5.3시험 방법
- 시료는 자외선 흡수 스펙트럼이 시험 시료의 최대 흡수 파장 근처에서 급격하게 변화를 보이는 것을 사용함
- Benzaldehyde의 경우에는 214와 254nm에서, benzoic acid의 경우에는 280nm에서 측정함
- 가장 진한 농도로 직선 범위를 초과하는 농도(일반적으로 2AU 이상의 흡광도를 나타내는)를 선택함
가. 시료 용액의 제조
- 용매로 사용하는 메탄올은 HPLC 등급을 사용함
(1) 원액으로 50mg/50m의 benzaldehyde/methanol 용액(1000ppm)을 제조한다.
(2) 직선 범위에 포함되도록 원액을 연속적으로 희석하여 희석 용액을 제조한다.
(3) Benzaldehyde의 경우에는 직선 범위가 2.5-25 ug/ml이고 benzoic acid의 경우에는 25-400 ㎍/ml이다.
나. 직선 범위 측정 방법
- 시료 용액의 농도가 진하여 출력 범위를 벗어나는 경우에는 출력 범위를 조절하면서 측정함
(1) 원액 제조 시 사용한 메탄올로 바탕선이 안정화될 때까지 크로마토그래피 시스템에 흘려준다.
(2) 영점 조정을 한 후 가장 묽은 농도의 시료 용액을 주입하여 얻어지는 검출기 감응을 기록한다.
(3) 시료 용매로 충분히 검출기를 세척한 후 농도를 올려가며 위의 순서를 반복하여 각 농도에 대한 검출기 감응을 기록한다.
2.5.4 데이터 처리
(1) 각 시험 용액에 대해 검출기 감응(AU)과 농도(㎍/ml)의 비를 계산하여 이 비대 log 농도의 그래프를 그린다.
(2) 시료의 직선 범위가 나타나는 농도 구간에서 감응과 농도 비의 평균값을 구하여 수평선(Rc)으로 처리한다.
(3) (2)에서 구한 수평선보다 5% 낮은 수평선(0.95 Rc)을 그어 직선 범위의 상한선을 구하고 검출기 감응과 농도의 비대 log 농도 그래프에서 도시한 직선과의 교점으로부터 상한선의 농도(CU)를 구한다.
(4) (2)에서 구한 수평선보다 5% 높은 수평선(1.05 Rc)을 그어 직선 범위의 하한선을 구하고 검출기 감응과 농도의 비대 log 농도 그래프에서 도시한 직선과의 교점으로부터 하한선의 농도(CL)를 구한다
(5) 직선 범위는 다음 식으로부터 구한다.
L.R = CU/CL
L.R : 검출기의 직선 범위
CU : 직선 범위의 상한선 농도 (㎍/ml)
CL : 직선 범위의 하한선 농도 (㎍/ml)
그림 2-9 Linear Range 측정방법
2. 6 최소 검출량 (Minimum detectability)
2.6.1 표시 방법
O ug/mL
2.6.2 정의
검출기가 정적 단시간 잡음의 두 배에 해당하는 감응을 나타내는 특정 용매에의 특정 용질의 농도
2.6.3 시험 방법
가. 시료 용액의 제조
직선 범위를 측정한 원액 및 희석 용액
나. 최소 검출량 측정 방법
(1) 원액 제조 시 사용한 메탄올로 바탕선이 안정화될 때까지 크로마토그래피
시스템에 흘려준다.
(2) 영점 조정을 한 후 가장 묽은 농도의 시료 용액을 주입하여 얻어지는 검출
기 감응을 기록한다.
(3) 시료 용매로 충분히 검출기를 세척한 후 농도를 올려가며 위의 순서를
반복하며 각 농도에 대한 검출기 감응을 기록한다.
2.6.4 데이터 처리
(1) 각각의 시료 용액에 대한 log 감응 대 log 농도를 도시한다.
(2) 추세선을 그려 직선의 기울기를 구한다.
(3) 기울기로부터 정적 단시간 잡음의 2배에 해당하는 농도를 얻는다.
제 3절. 굴절률 검출기 성능평가
1. 배경
다음은 굴절률 검출기의 성능 평가를 위한 평가 항목 및 시험방법이다..
1.1 용어 정의
다음의 성능 평가 방법에서 사용하는 주된 용어의 정의는 KS M 0126(분석 화학 용어-기초 부문)에 따른다.
용어 |
정의 |
영점 조정 |
투과 백분율 눈금 지시계의 지시를 영의 눈금에 조정하는 조작 |
측정값 |
측정에 의해 얻어지는 값 |
평균값 |
서로 더하여 평균한 값 |
증류수 |
증류 정제하여 소정의 조건을 만족하는 물 |
초순수 |
증류 및 이온 교환을 하고 다시 이온 교환, 역삼투 또는 한정된 외의 여과 등을 하여 고도로 정제한 물 |
용리액 |
칼럼에 유지되어 있는 시료 성분을 전개, 용출시키기 위하여 사용하는 액체 |
시료 용액 (sample solution) |
시료를 용액으로 한 것 또는 분석용으로 채취한 용액 |
원액 (stock solution) |
(1) 사용할 때마다 진하게 조제하며 보존의 목적을 겸한 시약 용액 (2) 분취하여 분석하기 위한 시료 용액 |
1.2 - 평가항목
- 잡음 수준
- 표류
- 감도 및 직선 범위
- 최소 검출량 및 동적 범위
2. 성능평가 시험방법
2.1잡음 수준 (Noise level)
2.1.1 표시 방법
O RIU (굴절지수 단위)
2.1.2 정의
- 단시간 잡음 (Short-term noise)
분당 하나 혹은 그 이상 주기의 주파수를 가진 검출기 신호의 무작위적인 변이도에 대한 RIU로 표시된 평균 진폭
- 장시간 잡음 (Long-term noise)
시간 당 6에서 60 주기(분당 0.1에서 1.0 주기)의 주파수를 갖는 검출기 신호의 무작위적인 변이도에 대한 RIU로 표시된 최고 진폭
2.1.3 시험 방법
- 잡음과 표류 측정에는 최소의 불순물을 함유해야 하므로 0.45um의 필터를 통해 여과시킨 초순수를 사용하며 실험실 대기와의 온도 평형을 위해 여러 시간동안 뚜껑을 덮은 용기에 넣어 보관한다.
- 검출기 셀의 온도를 조절하고 바탕선의 흔들림을 방지하기 위하여 컬럼 오븐을 사용한다
정적 상태 – 흐름이 없는 조건 하에서의 실험
동적 상태 – 1.0ml/min의 유속으로 흘려주는 조건 하에서의 실험
2.1.3.1 정적 잡음 (static noise)
(1) 스테인레스 스틸 튜빙으로 펌프, 주입구, 컬럼, 검출기 사이를 연결한다.
(2) 전 실험에 사용했던 용매를 제거하기 위하여 메탄올과 아세톤과 같은 중간 용매로 펌프와 검출기를 세척한 후 준비한 시험 용매로 용매 용기와 펌프, 검출기를 세척하면서 시스템에 시험용매를 서서히 채운다.
(3) 시스템의 온도를 설정한 후 퍼지 상태로 3시간 이상 펌프와 검출기를 가동시켜 기기를 충분히 안정시킨다.
(4) 출력값이 안정해지면 퍼지 상태를 중지한 후 펌프의 가동을 멈추고 최소 1시간 이상 안정시킨다.
(5) 영점 조정을 한 후 정적 조건 하에서 적어도 1시간 동안 바탕선을 기록한다.
2.1.3.2 동적 잡음 (Dynamic noise)
(1) 스테인레스 스틸 튜빙으로 펌프, 주입구, 컬럼, 검출기 사이를 연결한다.
(2) 전 실험에 사용했던 용매를 제거하기 위하여 메탄올과 아세톤과 같은 중간 용매로 펌프와 검출기를 세척한 후 준비한 시험 용매로 용매 용기와 펌프, 검출기를 세척하면서 시스템에 시험용매를 서서히 채운다.
(3) 시스템의 온도를 설정한 후 퍼지 상태로 3시간 이상 펌프와 검출기를 가동시켜 기기를 충분히 안정시킨다.
(4) 출력값이 안정해지면 퍼지 상태를 중지한 후 펌프의 유속을 1.0ml/min로 유지하여 최소 1시간 이상 안정화시킨다.
(5) 영점 조정을 한 후 동적 조건 하에서 적어도 1시간 동안 바탕선을 기록한다.
2.1.4 데이터 처리
2.1.4.1 정적 잡음
가. 정적 단시간 잡음
- 0.5에서 1분 사이의 간격으로 평행한 두 선을 그려 15분 동안 관찰된 모든 변수의 기울기를 구한다.
(1) 두 선 사이의 거리를 최소화하기 위한 평행선을 그린다.
(2) 시간 축에 대해 수직인 평행선 사이의 거리(cm 또는 mV)를 측정하고 이 값을 보정 인자를 사용하여 RIU로 전환한다.
(3) 모든 간격에 대한 평균값을 계산하고 이 값을 셀 길이(cm)로 나눈다
그림 2-10 Short-term Noise 측정방법
나. 정적 장시간 잡음
- 15분 정도 정적 단시간 잡음을 측정하여 각 간격의 중앙을 표시함
(1) 10분 단위로 각 선들의 중앙점을 이어 평행선을 연속으로 그린다.
(2) 시간 축에 대해 수직거리가 가장 큰 평행선을 선택한다.
(3) 이 값을 셀 길이(cm)로 나눈다
그림 2-11 Long-term Noise 측정방법
2.1.4.2 동적 잡음
가. 동적 단시간 잡음 (그림 2-10 참조)
0.5에서 1분 사이의 간격으로 평행한 두 선을 그려 15분 동안 관찰된 모든 변수의 기울기를 구함
(1) 두 선 사이의 거리를 최소화하기 위한 평행선을 그린다.
(2) 시간 축에 대해 수직인 평행선 사이의 거리(cm 또는 mV)를 측정하고 이 값을 보정 인자를 사용하여 RIU로 전환한다.
(3) 모든 간격에 대한 평균값을 계산하고 이 값을 셀 길이(cm)로 나눈다
나. 동적 장시간 잡음 (그림 2-11 참조)
- 15분 정도 정적 단시간 잡음을 측정하여 각 간격의 중앙을 표시함
(1) 10분 단위로 각 선들의 중앙점을 이어 평행선을 연속으로 그린다.
(2) 시간 축에 대해 수직거리가 가장 큰 평행선을 선택한다.
(3) 이 값을 셀 길이(cm)로 나눈다
2. 2. 표류 (Drift)
2.2.1 표시 방법
O RIU/h
2.2.2 정의
일정한 조건 하에서 측정값 이외의 영향에 의해 바탕선이 변동하는 것으로 그 정도를 RIU/h로 표시한 것
2.2.3시험 방법
가. 정적 표류
- 스테인레스 스틸 튜빙은 내경 0.01 inch를 사용함
- 시험 용매로는 초순수를 사용함
(1) 스테인레스 스틸 튜빙으로 펌프, 주입구, 컬럼, 검출기 사이를 연결한다.
(2) 전 실험에 사용했던 용매를 제거하기 위하여 메탄올과 아세톤과 같은 중간 용매로 펌프와 검출기를 세척한 후 준비한 시험 용매로 용매용기와 펌프, 검출기를 세척하면서 시스템에 시험 용매를 서서히 채운다.
(3) 시스템의 온도를 설정한 후 퍼지 상태로 3시간 이상 펌프와 검출기를 가동시켜 기기를 충분히 안정시킨다.
(4) 출력값이 안정해지면 퍼지 상태를 중지한 후 펌프의 가동을 멈추고 최소 1시간 이상 안정시킨다.
(5) 영점 조정을 한 후 정적 조건 하에서 적어도 1시간 동안 바탕선을 기록한다.
나. 동적 표류
- 스테인레스 스틸 튜빙은 내경 0.01 inch를 사용함
- 시험 용매로는 초순수를 사용함
(1) 스테인레스 스틸 튜빙으로 펌프, 주입구, 컬럼, 검출기 사이를 연결한다.
(2) 전 실험에 사용했던 용매를 제거하기 위하여 메탄올과 아세톤과 같은 중간 용매로 펌프와 검출기를 세척한 후 준비한 시험 용매로 용매 용기와 펌프, 검출기를 세척하면서 시스템에 시험용매를 서서히 채운다.
(3) 시스템의 온도를 설정한 후 퍼지 상태로 3시간 이상 펌프와 검출기를 가동시켜 기기를 충분히 안정시킨다.
(4) 출력값이 안정해지면 퍼지 상태를 중지한 후 펌프의 유속을 1.0ml/min로 유지하여 최소 1시간 이상 안정화시킨다.
(5) 영점 조정을 한 후 동적 조건 하에서 적어도 1시간 동안 바탕선을 기록한다.
2.2.4 데이터 처리
가. 정적 표류
1시간 동안 측정한 검출기 신호의 수직 거리를 최소화하는 평행선 쌍을 그려
평행선의 기울기를 구한다.
나. 동적 표류
1시간 동안 측정한 검출기 신호의 수직 거리를 최소화하는 평행선 쌍을 그려 평행선의 기울기를 구한다.
그림 2-12 Drift 측정방법
2. 3. 감도 및 직선 범위 (Sensitivity and linear range)
2.3.1 표시 방법
가. 감도
O RIU·L/g
나. 직선 범위
O
2.3.2 정의
가. 감도
시험 용매에 대한 시험 물질의 단위 농도 당 출력되는 시그널
S = R/C
S = 감도 (반응 요소), 굴절률U·L/g
R = 측정된 검출기 반응. 굴절률U
C = 테스트 용매의 테스트 물질의 농도 g/L
나. 직선 범위
직선성 그래프에서 ±5%이내의 일정한 검출기 감도를 나타내는 시험물질의
농도범위
- 직선범위는 시험 물질의 감도 대 log농도를 측정한 그래프로부터 구한 직선상의 상한선(-5%)과 하한선(+5%)의 농도 비로 나타냄
L.R = Cmax/Cmin
L.R = 검출기의 직선 범위
Cmax = 직선 범위의 상한선 농도(g/L)
Cmin = 직선 범위의 하한선 농도(g/L)
2.3.3 시험 방법
- 용리액과 시료 희석용 용매는 초순수를 사용하며 실험실 대기와의 온도 평형을 위해 여러 시간동안 뚜껑을 덮은 용기에 넣어 보관함
- 증류수에 대한 측정값이 1× 10-4 RIU인 용액을 정상 용액이라 하고 그것을 농도 1로 정의함
- 스테인레스 스틸 튜빙은 내경 0.01 inch를 사용함
가. 시료 용액의 제조
(1) 글리세린(glycerin) 43.6g을 초순수 1L에 용해시켜 원액을 제조한다.
(2) (1)의 원액을 상대 농도 50으로 표준화한다.
이 시료 용액은 보정에 사용된 기준 용액 농도의 50배이다.
(3) 상대 농도 50의 시료 용액을 연속적으로 희석하여 상대 농도 0.01까지 희석 용액을 만든다.
나. 감도 및 직선 범위 측정
- 시료 용액의 농도가 진하여 출력 범위를 벗어나는 경우에는 출력 범위를 조절하면서 측정함
(1) 스테인레스 스틸 튜빙으로 펌프, 시료 주입구, 컬럼, 검출기 사이를 연결한다.
(2) 검출기의 온도를 35℃, 펌프의 유속을 1.0ml/min으로 설정한 후 용리액을 흘리면서 퍼지 상태로 약 2시간 정도 시스템을 안정화시킨다.
(3) 출력값이 안정되면 퍼지 상태를 중지한 후 바탕선이 안정화되면 영점 조정을 한다.
(4) 시료 주입기에 가장 묽은 농도의 시료 용액을 주입한 후 얻어지는 출력값(cm 또는 mV)을 기록한다.
(5) 농도를 올려가며 각 시료 용액에 대한 출력값을 얻는다.
2.3.4 데이터 처리
가. 감응표 작성
(1) 검출기 감응은 각 시험 용액의 크로마토그램에서 측정한 높이 값을 사용한다.
(2) 모든 시료 용액의 감응은 적당한 눈금인자를 측정된 검출기의 응답에 곱하여 정상 용액(C=0.872 g/L)의 감응 측정 범위로 환산한다(REC=1).
(3) 다음 과정에 의해 보정 인자를 구한다.
- 상대 농도 1.0(=0.872 g/L)인 정상 용액의 경우 시료와 물의 굴절률 차이 값이 정의에 의해 1×10-4 RIU이다. 따라서 상대농도 0.5와 1.0인 시료 용액의 굴절률 차이는 5×10-5 RIU가 된다.
- 같은 검출기 범위 설정(REC=1)으로 상대 농도 1.0과 0.5의 시료 용액에 대해 검출기 감응(cm 또는 mV)을 측정한다.
- 5×10-5 RIU를 상대농도 1.0과 0.5인 시료 용액의 검출기 감응 차이로 나누어 RIU/cm의 보정 인자를 계산한다.
- 크로마토그램의 경우 cm대신 mV를 사용하여도 무방하다.
(4) 검출기 감응을 (3)에서 구한 보정 인자를 사용하여 RIU로 전환한다.
(5) 검출기의 감응(RIU)을 실제 농도로 나누어 각각의 시험 용액에 대해 감도를 계산한다.
- 시험 용액의 감응 범위는 물에 대해 5×10-3 RIU에서 1×10-6 RIU의 범위에 포함되어야 함
표 2-1감응표 작성 예시
상대 농도 |
실제농도 (g/L) |
감응 (cm 또는 mV) |
검출기 범위 |
감응 눈금 (rec=1로 환산) |
감응 (RIU) |
감도 (RIU·L/g) |
50 20 10 5 2 1 0.5 0.2 0.1 0.05 0.02 0.01 |
43.6 17.4 8.72 4.36 1.74 8.72×10-1 4.36×10-1 1.74×10-1 8.72×10-2 4.36×10-2 1.74×10-2 8.72×10-3 |
|
|
|
|
|
나. 직선 범위
(1) 감응표의 결과를 사용하여 감도(RIU/실제농도) 대 log농도의 그래프를 그린다.
(2) 시료의 직선 범위가 나타나는 농도 구간에서 감도의 평균값을 구하여 수평선(S)으로 처리한다.
(3) (2)에서 구한 수평선보다 5% 낮은 수평선(0.95 S)을 그어 직선 범위의 상한선을 구하고 감도 대 log 농도 그래프에서 도시한 직선과의 교점으로부터 상한선 농도(Cmax)를 구한다.
(4) (2)에서 구한 수평선보다 5% 높은 수평선(1.05 S)을 그어 직선 범위의 하한선을 구하고 감도 대 log 농도 그래프에서 도시한 직선과의 교점으로부터 하한선 농도(Cmin)를 구한다.
(5) 직선 범위는 다음 식으로부터 구한다.
L.R=Cmax/Cmin
L.R = 검출기의 직선 범위
Cmax = 직선 범위의 상한선 농도(g/L)
Cmin = 직선 범위의 하한선 농도(g/L)
그림 2-13 Linearity Plot
2.4. 최소 검출량 및 동적 범위 (Minimum detectability and dynamic range)
2.4.1표시 방법
가. 최소 검출량
O ㎍/㎖
나. 동적 범위
O
2.4.2 정의
가. 최소 검출량
검출기가 정적 단시간 잡음의 두 배에 해당하는 신호를 나타내는 특정 용매에 대한 특정 용질의 농도
나. 동적 범위
상한선인 최대 검출량과 하한선인 최소 검출량의 비율
Dynamic Range= Cupper limit /Clower limit
상한선 (Cupper limit) : 최대 검출량
- 감응(RIU) 대 농도 그래프에서 각 포인트에 대하여 접선을 그었을때 그 기울기가 0이 되기 시작하는 농도 또는 측정한 가장 큰 농도
하한선 (Clower limit) : 최소 검출량
2.4 3 시험방법
- 시료 용액은 감도 및 직선 범위 측정 시 사용한 원액과 그 희석 용액들을 사용함
(1) 스테인레스 스틸 튜빙으로 펌프, 시료 주입구, 컬럼, 검출기 사이를 연결한다.
(2) 검출기의 온도를 35℃, 펌프의 유속을 1.0ml/min으로 설정한 후 용리액을 흘리면서 퍼지 상태로 약 2시간 정도 시스템을 안정화시킨다.
(3) 출력값이 안정되면 퍼지 상태를 중지한 후 바탕선이 안정화되면 영점 조정을 한다.
(4) 시료 주입기에 가장 묽은 농도의 시료 용액을 주입한 후 얻어지는 출력값(cm 또는 mV)을 기록한다.
(5) 농도를 올려가며 각 시료 용액에 대한 출력값을 얻는다.
2.4.4 데이터 처리
가. 동적 범위의 상한선 (Cupper limit)
- 검출기 감응(RIU)은 2.3.4의 가. 감응표를 참조함
(1) 검출기 감응(RIU) 대 실제 농도의 그래프를 각 데이터 점들을 통과하는 부드러운 곡선으로 그린다.
(2) 그래프의 각 포인트에 접선을 그었을 때 접선의 기울기가 0이 되기 시작하는 농도를 구한다.
(3) 접선의 기울기가 0이 되기 시작하는 농도를 찾기 힘든 경우 시험에서 사용한 가장 큰 농도를 사용한다.
그림 2-14 Dynamic Plot
나. 동적 범위의 하한선 (Clower limit) : 최소 검출량
(1) 각 시료에 대한 log 감응 대 log 농도의 그래프를 도시한다.
(2) 추세선을 그려 직선의 기울기를 구한다.
(3) 기울기로부터 정적 단시간 잡음의 2배에 해당하는 농도를 얻는다.
그림 2-15 Log-Log Dynamic Plot
다. 동적 범위
동적 범위는 다음 식으로부터 구한다.
D.R=Cupper limit /Clower limit
D.R = 검출기의 동적 범위
Cupper limit (상한선) = 최대 검출량
Clower limit (하한선) = 최소 검출량
제 4절. 컬럼온도제어계 성능평가
1. 배경
다음은 컬럼 온도제어계의 성능 평가를 위한 평가항목 및 시험방법이다.
1.1 용어정의
- 다음의 성능 평가 방법에서 사용하는 주된 용어의 정의는 KS M 0126(분석 화학 용어-기초 부문)에 따른다.
용어 |
정의 |
분산 |
측정치의 크기가 가지런하지 않은 것 - 분산의 크기를 표시하는데 보기를 들면 표준 편차를 이용함 |
정밀도 |
측정치에서 분산의 정도 - 보기를 들면 표준 편차로 표시함 - KS A 3009에서는 분산이 작은 정도를 정밀성이라고 하고 정확성과 정밀성을 포함한 종합적인 양호도를 정밀도라 함 |
정확성 |
참값으로부터 편중된 정도 |
편차 (바이어스) |
측정치 또는 평균치로부터 참값을 뺀 값 |
편차 |
측정치로부터 그 기대치(통상은 평균치)를 뺀 값 |
평균값 |
서로 더하여 평균한 값 |
표준편차 |
분산의 제곱근의 절대값 |
1.2 시험 평가항목
- 온도 설정 정확도
- 온도 제어 정밀도
1.3. 고려사항
- 컬럼 온도 제어계의 평가를 위해 사용하는 온도 측정계는 검교정된 계기를 이용함
2. 성능평가 시험방법 및 결과 데이터
2.1. 온도 설정 정확도 (Accuracy of temperature setting)
2.1.1 표시 방법
± O.O ℃
2.1.2 정의
분리 컬럼용 항온조의 설정온도와 실제 측정온도의 차이
2.1.3 시험 방법
- 온도 측정 위치를 2 지점 지정함
- 컬럼 오븐의 측정 가능한 온도 범위 중 임의의 한 온도를
선택함.
(1) 일정한 위치에 heat probe를 고정시킨다.
(2) 컬럼 오븐의 온도를 설정한다.
(3) 설정된 온도로 온도를 올리고 안정해질 때까지 방치한다.
(4) 온도 측정계에 표시되는 온도 값을 읽는다.
2.1.4 데이터 처리
설정온도와 온도 측정계에 표시된 온도를 비교한다.
2.1.5 오차의 허용 범위
허용되는 오차 범위는 설정 온도의 ±1.0 ℃ 미만이다.
2.2 온도 제어 정밀도 (Precision of temperature control)
2.2.1 표시 방법
± O.O ℃
2.2.2 정의
항온조 내의 설정온도에 따른 온도 편차
2.2.3 시험 방법
- 컬럼 온도 제어계의 측정 가능한 온도 범위 중 임의의 한 온도를 선택함
(1) 일정한 위치에 heat probe를 고정시킨다.
(2) 컬럼 온도 제어계의 온도를 설정한다.
(3) 온도가 안정해지면 30분 동안 온도 측정계에 표시되는 온도 값을 5분 단위로 읽는다.
(4) 방치하면서 온도 측정계에 표시되는 온도 변화값을 읽는다.
2.2.4 데이터 처리
측정 온도의 평균을 구해 각 측정치로부터의 편차 중 가장 큰 값을 구한다.
2.2.5 오차의 허용 범위
허용되는 오차 범위는 ± 1.0℃ 미만이다.