분리 또는 증식된 세포를 포함하는 발달성, 만성 폐질환 치료용 조성물 (Method1. 특허명칭 of Treating Lung Diseases Using Cells Separated or Proliferated from Umbilical Cord Blood) | |
2. 특허 주요내용 | 제대혈로부터 분리한 자가조혈모세포 또는 간엽줄기세포를 기도내에 투입하는 것을 특징으로 하는, 발달성, 만성 폐질환의 치료용 조성물로서, 이 기술이 치료하고자 하는 발달성, 만성 폐질환은 낭포성 섬유증, 만성폐쇄성폐질환, 및 폐이형성증을 포함한다. |
3. 특허권자 | 사회복지법인 삼성생명공익재단, 메디포스트㈜ |
4. 특허취득일자 | 2012-10-15 |
5. 특허 활용계획 | 이 특허 기술은 성인의 낭포성 섬유증(cystic fibrosis), 폐기종(emphysema) 등과 같은 만성 폐쇄성 질환과 신생아 및 미숙아의 기관지폐이형성증(bronchopulmonary dysplasia) 등의 치료에 사용될 수 있다. |
6. 확인일자 | 2012-10-15 |
7. 기타 투자판단에 참고할 사항 |
ㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡ
(특허권자중 삼성생명공익재단은 삼성의료원이 주축이고
이건희 회장이 오래 전부터 의료시설에 관심을 갖고 시설
개선에 힘을 쏟았다고 한다.
작년에 삼성생명공익재단 이사장에 취임했습니다)
(19)대한민국특허청(KR)
(12) 공개특허공보(A)
(51) 。Int. Cl.
A61K 35/14 (2006.01)
A61P 11/00 (2006.01)
(11) 공개번호
(43) 공개일자
10-2007-0079316
2007년08월06일
(21) 출원번호 10-2007-0010191
(22) 출원일자 2007년01월31일
심사청구일자 2007년01월31일
(30) 우선권주장 1020060009625
PCT/KR2006/003009
2006년02월01일
2006년07월31일
대한민국(KR)
세계지적재산권기구(WIPO)(WO)
(71) 출원인 사회복지법인 삼성생명공익재단
서울 용산구 한남동 742-3
메디포스트(주)
서울시 서초구 서초3동 1571-17
(72) 발명자 장윤실
서울 송파구 오륜동 올림픽선수촌아파트 218-307
박원순
경기 성남시 분당구 야탑동 190 분당 동원로얄듀크아파트
140-902
양윤선
서울 서초구 서초3동 1571-17 메디포스트(주)
(74) 대리인 장성구
이현실
전체 청구항 수 : 총 9 항
(54) 제대혈로부터 분리 또는 증식된 세포를 포함하는 발달성
,만성 폐질환 치료용 조성물
(57) 요약
본 발명은 제대혈로부터 분리 또는 증식된 세포를 유효성분
으로 포함하는 발달성, 만성 폐질환 치료용 조성물에 관한
것으로, 본 발명의 치료용 조성물을 환자의 기도로 직접 투여
함으로써 발달성, 만성 폐질환을 효과적으로 치료할 수 있다.
(특허에 대한 메디가 갖는 권리입니다)
청구항 1.
제대혈로부터 분리 또는 증식된 세포를 유효성분으로 포함
하는 발달성, 만성 폐질환 치료용 조성물.
청구항 2.
제 1 항에 있어서,
상기 세포가, 제대혈로부터 분리된 단핵구 세포, 제대혈로
부터 분리된 간엽줄기세포, 상기 간엽줄기세포로부터 계대
배양에 의해 증식된 간엽줄기세포 및 이들의 혼합물로 이루
어진 군으로부터 선택되는 세포인 것을 특징으로 하는 발달성, 만성 폐질환 치료용 조성물.
청구항 3.
제 2 항에 있어서,
상기 단핵구 세포가 조혈모세포 및 간엽줄기세포를 포함하는
것을 특징으로 하는 발달성, 만성 폐질환 치료용 조성물.
청구항 4.
제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 조성물이 배양배지, 폐질환 치료에 효과적인 유전자
또는 이를 포함하는 발현벡터, 자가분비 (autocrine) 또는
측분비 (paracrine) 효과를 제공하는 사이토카인, 성장인자 (growth factor), 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택
된 보조성분을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 발달성
, 만성 폐질환 치료용 조성물.
청구항 5.
제 4 항에 있어서,
상기 배지가 DMEM, MEM, α-MEM, McCoys 5A 배지, 이글스
기본 배지 (eagle's basal medium), CMRL 배지, 글래스
고우 (Glasgow) 최소 필수 배지, 햄스 (Ham's) F-12 배지,
IMDM (Iscove's modified Dulbecco's medium), 리보비츠
(Liebovitz') L-15 배지 및 RPMI 1640 배지로 이루어지는
군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 발달성, 만성
폐질환 치료용 조성물.
청구항 6.
제 1 항에 있어서,
상기 조성물이 환자의 기도 내에 투여되는 것을 특징으로
하는 발달성, 만성 폐질환 치료용 조성물.
청구항 7.
제 1 항에 있어서,
상기 발달성, 만성 폐질환이 낭포성 섬유증, 만성 폐쇄성
폐질환 또는 기관지 폐 이형성증인 것을 특징으로 하는
발달성,만성 폐질환 치료용 조성물.
청구항 8.
제 1 항의 조성물로부터 제조된 발달성, 만성 폐질환 치료용
제제.
청구항 9.
제 8 항에 있어서,
상기 제제가 주사제, 주입제 또는 분무제임을 특징으로 하는
발달성, 만성 폐질환 치료용 제제.
본 발명은 제대혈로부터 분리 또는 증식된 세포를 유효성분
으로 포함하는 발달성, 만성 폐질환 치료용 조성물에 관한
것이다.
발달성, 만성 폐질환에는 성인의 낭포성 섬유증 (cystic fibro
sis), 폐 기종 (emphysema) 등과 같은 만성 폐쇄성 폐질환
(chronic obstructive lung disease, COPD) 및 신생아 및 미숙
아의 기관지 폐 이형성증 (bronchopulmonary dysplasia)
등이 있다.
(인류가 가진 질병은 수많은것이 있습니다
그러나 메디를 공부해 보면 인류가 가진 질병중 아직까지
모든 의약품이 고치지 못한것을 연구하고 특허하고 임상실험
을 거친것을 알수 있습니다
그리고 불치병중 수많은분들이 고통받는것이 포함되고
있음을 알수 있습니다
멀리 볼것이 아니라 우리나라 최대 재벌인 이병철회장님이나
정주영 회장님도 폐질환 때문에 돌아가셨습니다
현재 삼성 회장인 이건희 회장님도 폐질환을 앓고 있습니다
결국 이 특허가 포함된 뉴모스템이 상품화 될때 파급효과
는 관절염 완치제 카티스템이나 , 치매및 뇌종양 치료제
뉴로스템에 버금가는 시장성과 환우들에게 빛과 희망이
될것입니다
모르긴 해도 메디랑 형제들중에도 골초가 계신다면 뉴모스템
예비 대기자가 될수 있을것입니다)
이 질환들은 질병의 심각성과 만성 유병 상태에 비하여
이를 예방하고 치료할 수 있는 효과적인 방법이 없다는데
에 심각한 문제가 있다.
(아직까지 흔한 폐질한 치료제가 인류에 없었습니다
그래서 이특허를 기반으로 한 뉴모스템이 상품승인을 받
는다면 인류에 새로운 희망이 될것입니다
그런데 메디의 기술은 벌써 사람을 대상으로 한 임상2상에
들어갔다는것입니다
그리고 뉴스에서도 나왔듯이 임상2상후 조기 상품승인을
신청 한다고 하였는데 하루빨리 상품승인이 되어서 꺼져
가는 생명에 희망이 되기를 바랍니다)
예를 들어, 기관지 폐 이형성증은 주로 미숙아 및 신생아의
호흡부전이나 이로 인한 인공호흡기 치료로 인하여 발생
하는 만성 폐질환으로 최근 미숙아 치료가 활발하게 진행됨
으로써 이 질환의 발병빈도가 증가하고 있다 (Avery ME et al.,
Pediatrics 79:26-30, 1987).
이는 신생아 특히 미숙아 사망의 주요 원인질환일 뿐만
아니라 생존아의 경우에도 입원기간이 장기화되고, 폐동
맥 고혈압과 같은 심각한 후유증을 유발하거나 퇴원 이
후에도 바이러스성 급성 모세기관지염과 폐렴등으로
재입원이 필요한 경우가 50% 이상이며, 또한 장기적
으로 기관지의 과민성이 증가되어 기관지 천식으로 전환
되는 경우도 많고 (Coalson JJ. Semin Neonatol, 8:73-81,
2003),
궁극적으로 뇌성마비와 같은 심각한 신경학적 후유증과
연관되는 것으로 알려져 있다 (Bregman J and Farrell EE,
Clin Perinatol, 19:673-94, 1992).
현재 다른 성인의 만성폐질환과 마찬가지로 기관지 폐
이형성증에는 효과적이고 뚜렷한 치료법이 개발되어
있지 않다.
(기관지 폐 이형성증은 여러분들도 생소하신분이 계실것
입니다
기관지 폐 이형성증은 주로 미숙아 및 신생아의 호흡부전
이나 이로 인한 인공호흡기 치료로 인하여 발생하는 만성
폐질환으로 최근 미숙아 에게 많이 생긴다고 합니다
원인은 환경과 신인류가 격어야할 재앙으로 봅니다
그러나 뉴모스템은 성인들 폐질환은 물론이고 미숙아
기관지 폐 이형성증에 완치제가 될수 있습니다
이제까지 치료제가 없어서 발만 둥둥 굴리던 환자및 그 가족
들을 생각하면 한시빨리 상품승인이 되기를 바랍니다)
신생아 및 미숙아의 인공환기 치료시 양압환기에 의한 압력
및 부피 손상, 및 산소농도를 줄여 치료해 보려는 물리적인
노력이 주를 이루고 있고, 아울러 손상된 폐 염증을 줄이는
치료인 스테로이드 요법이 예방과 치료법으로 사용되었으
나 미숙아 에서 사용한 경우 신경학적으로 좋지 않은 예후,
특히 뇌성마비의 증가와 연관이 있다는 보고들이 있어 사용
이 제한되고 있는 실정이다 (Committee on Fetus and Newborn, Pediatrics, 109:330-8, 2002).
최근 모든 장기로 분화가 가능한 줄기세포 치료에 대한 기대가 고조되고 있는데, 분화능이 매우 뛰어난 배아줄기세포 이식
의 경우 제어가 불가능한 기형종의 발생 또는 유전체 각인 (imprinting)을 통한 발달학적 문제, 및 무엇보다도 중요한 윤리
적 문제로 말미암아 제약을 받고 있어 성체줄기세포에 대한
관심이 높아지고 있다.
성체 줄기세포로는 조혈계 줄기세포가 주목을 받고 있는데,
조혈계 줄기세포원인 골수에는 현재까지 크게 두 종류의 줄기
세포가 알려져 있다.
첫째가 조혈줄기세포 (hematopoietic stem cell)이고
둘째가 간엽줄기세포 (mesenchymal stem cell)이다.
골수의 조혈줄기세포가 형성성 (plasticity)을 갖고 있어 조혈
계 세포뿐만 아니라 각종 장기의 다른 세포로 분화된다는 것
이 이미 알려져 있으나 (Gussoni E et al. Nature, 401:390-394, 1999; Petersen BE et al., Science, 284:1168-1170,
1999; Mezey E et al., Science, 290:1779-1782, 2000; 및 Krause DS et al., Cell, 105:369-377, 2001), 이는 매우 드물게 일어나서 생체학적으로 적절한 유용성을 갖기에는 한계가
있을 뿐만 아니라, 이러한 결과가 한편으로는 세포 융합 (fusion)에 의한다는 보고도 있다 (Wagers AJ et al., Science, 297:2256-2259, 2002).
(결국 골수의 줄기세포는 줄기세포에서 가장 염려스러운
형성성 (plasticity)을 갖고 있어 조혈계 세포뿐만 아니라 각종
장기의 다른 세포로 분화된다는 것은 결국 의약품이 되기
힘든다는것입니다
다른장기가 생긴다면 줄기세포 치료제중 가장 치명적이 될
것입니다)
이에 비하여 성인 쥐의 골수에서 분리된 '만능분화성 성인성
전구 세포' (multipotent adult progenitor cell, MAPC)로 명명
된 간엽줄기세포는 3가지 모든 배엽, 즉 외배엽, 중배엽 및
내배엽으로의 분화가 가능하고 쥐의 주머니배 (blastocyst)
에 주입하였을 때 거의 모든 장기 세포로 분화되는 뛰어난
분화능이 보고 되었으며, 이 세포들은 OCT-4, Rex-1 및
SSEA-1과 같은 배아줄기세포 표지자를 띤다고 알려져 있다 (Jiang Y et al., Nature, 418:41-49, 2002).
인간의 골수에서도 이와 비슷한 성상의 줄기세포가 분리
되어 (Reyes M et al., Blood, 98:2615-2625, 2001; 및
Woodbury D et al., J Neurosci Res., 61:364-370, 2000)
질병 및 손상에 대한 세포 치료영역 분야에 응용할 가능성이
높아져 매우 큰 주목을 받고 있다.
그러나, 골수는 나이가 듦에 따라 조혈줄기세포 및 간엽줄기
세포 구역이 줄어들고
(Geiger H et al., Nat Immunol., 3:329-333, 2002), 골수 채취
자체가 고통을 야기한다는 점으로 인하여 실제 적용 유용
성에 있어 매우 불리하므로 대안의 필요성이 지속적으로
제기되어 왔다.
제대 (umbilical cord)는 태아에 대한 모든 영양공급원이자
노폐물 배설기관인 모체의 태반과 태아를 이어주는 줄로서,
제대혈이란 이 안에 들어있는 혈액을 일컫는다.
제대혈은 조혈계 줄기세포를 채취하는데 있어 골수를 대신
할 가장 적절한 대안으로서 제시되고 있는데, 그 이유는
골수보다 제대혈 줄기세포들이 더욱 원시적이며 세포 채취
에 있어 용이하다는 점 때문이다.
제대혈의 조혈줄기세포 이식은 1980년대부터 이미 임상적
으로 이루어져 왔는데, 이는 제대혈이 골수에 비해 조혈 증식
능력이 뛰어난 원시 조혈모세포가 단위 부피당 더 많으며 (Szilvassy SJ et al., Blood, 98:2108-2115, 2001) 아울러 조직
적합성 항원 (human leukocyto antigen, HLA) 부적합이 골수
보다 적어 이식편 대 숙주 반응이 적고 (Rocha V et al., N
Engl J Med ., 342:1846-1854, 2000), 그 채취에 있어 덜
침습적이고 용이할 뿐만 아니라 (Rubinstein P et al., N Engl J
Med ., 339:1565-1577, 1998), 각종 암이나 이외의 질병에
서 자가 골수이식의 경우 생겨날 수 있는 위험성이 현저히 줄
어들 수 있다는 뛰어난 장점이 있기 때문이다. 특히 최근에 제대혈 보관은행이 생겨나 제대혈 보관 및 증식이 용이해지면
서 제대혈 조혈줄기세포 이식은 임상적으로 더욱 더 활발해
지고 있다.
제대혈에 간엽줄기세포, 특히 각종 장기세포로의 분화능이
매우 뛰어난 MAPC 유사세포가 존재하느냐에 대해서는 많은
논란이 있어 왔고, 초미의 관심사이다.
(저는 일요일 대왕의 꿈이란 역사극에서 왕이란 하늘이 내
리고 천운과 천시 와 민심을 얻어야 된다고 하는 대사가
생각이 나는군요
메디의 제대혈 선택은 그냥우연이 아닐것입니다
그러나 제대혈에서 세상의 모든 불치병 치료및 완치는
물론이고 새로운 생명이 재 탄생될수 있는 모든 비밀이
숨어 있습니다
제대혈의 선택은 줄기세포 연구하는 모 회사의 연구진이
메디는 운이 좋아서 재료선택을 잘했다고 하는데 ,저는 메디
가 제대혈을 선택한것은 천운과 천시를 잘 선택하였다고
봅니다
물론 메디랑 형제들도 지금은 마음고생이 심하고 시련과 근심속에 있지만 먼미래에는 우리의 선택이 스스로 자부할날이
있을것으로 생각합니다)
이는 무엇보다도 제대혈에서 이러한 세포를 다량으로 얻어
낼 수만 있다면 세포 치료 및 세포와 조직 재생 의학에 획기
적 전기를 마련할 가능성이 있기 때문이다.
제대혈 줄기세포군의 원시성으로 미루어 성인의 골수보다는
제대혈에 이러한 MAPC 유사 세포가 많을 것으로 예상하던
차에 최근 제대혈에서 간엽줄기세포를 분리하는데 성공하
였고 (Erices A et al., Br J Haematol., 109:235-242, 2000),
이들이 체외에서 골아세포, 지방세포, 신경 세포 계열로
분화하는 MAPC 세포와 유사한 다중 분화능이 있음 또한
증명되었다 (Lee OK et al., Blood, 103:1669-1675, 2004).
또한 제대혈에서 처음에 채취할 수 있는 간엽세포수가 매우
작고 이를 증폭하기 어렵다고 여겨져 왔으나, 최근 다량의
간엽줄기세포원으로서 이들의 체외 증폭이 가능해졌다 (Yang
SE et al, Cytohterapy, 6:476-486, 2004; 및 Kern SH et al.,
Stem Cells, 24:1294-1301, 2006).
이 세포들은 계대배양을 통해 증폭된 후에도 다분화성이 있어
체외에서 골아세포, 연골아세포, 지방세포, 신경계 세포로
분화하며, 생체 내에서도 신경세포로 분화하고 이주됨이 증명
되고 연골, 뼈, 조혈계세포 및 간세포로 분화됨이 증명되고
있다 (Kogler G et al., J Exp Med ., 200:123-135, 2004).
방법론적으로도 실제 태반조직에서 추출한 제대혈은 자가
및 동종 줄기세포의 가장 이상적인 공급원이 될 수 있으며,
또한 이렇게 수집된 줄기세포는 직접 사용하거나 또는 증식
과정 등을 거친 후에 필요한 시기에 필요한 양만큼 쉽게
사용할 수 있는 장점이 있다.
그러나, 아직까지 발달성, 만성 폐질환들에서 제대혈 유래
줄기세포 이식에 관한 연구가 수행된 적은 없다. 다만 성인
골수 줄기세포가 방사선에 의한 폐렴이 유도된 생쥐에서
이식 후 기관지세포와 제2형 폐 실질 세포 등으로 분화되었
으며 (Theise ND et al. Exp Hematol., 30:1333-1338, 2002),
또한 블레오마이신 투여 후에 발생하는 섬유화를 완화시켰다
는 일부 성인 동물실험 모델의 실험적 보고들이 있다 (Ortiz
L et al. Proc Natl Acad Sci USA, 100:8407-8411, 2003; 및
Rojas M et al., Am J Respir Cell Mol Biol., 33:145-152, 2005).
제대혈로부터 분리한 세포를 이용한 질병치료에 관련된 특허
로는, 대한민국 공개특허 제2003-0015160호에 제대혈로부
터 분리, 증식 또는 분화된 세포성분과 그 배지로 이루어진
관절연골손상 치료용 조성물에 관해 기술되어 있고, 대한민국
공개특허 제2005-0105467호에는 줄기세포를 고 투여량으로
사용하여 골수 이형성증 및 경화증을 치료하는 방법에 관해
기술되어 있다.
그러나, 상기 문헌 중 어느 것도 발달성, 만성 폐질환에서
제대혈 줄기세포 이식의 치료 효과에 대해 기술 하고 있지
않다.
(결국 제대혈에 대해서는 메디가 우선권이 있고 특허 권리
가 있다는것입니다)
이에, 본 발명자들은 신생 백서에 고농도 산소를 지속적으
로 투여하여 기관지 폐 이형성증 모델을 제작한 후, 본 발명
의 조성물을 기도 내 투여한 결과, 폐포 수가 증가하고 폐포
가 정상적으로 발달되며 투여된 세포가 폐 실질 세포로 분화
함을 관찰함으로써, 본 발명의 조성물이 발달성, 만성 폐질
환 치료에 이용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
발명이 이루고자 하는 기술적 과제
따라서, 본 발명의 목적은 발달성, 만성 폐질환의 치료를 위한
조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 환자의 기도 내에 투입
하는 것을 포함하는 발달성, 만성 폐질환의 치료방법을 제공
하는 것이다.
발명의 구성
된 세포를 유효성분으로 포함하는 발달성, 만성 폐질환 치
료용 조성물을 제공한다.
상기 다른 목적에 따라, 본 발명은 상기 조성물을 발달성, 만성 폐질환 환자에게 투여하는 것을 포함하는 발달성, 만성 폐
질환의 치료방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 조성물에 포함되는 치료용 세포의 기원 조직인
제대혈은 태반과 태아를 연결하는 제대정맥으로부터 채취
된 혈액으로 정의된다.
제대혈은 출산시 자연적으로 발생하는 부산물로서, 여러
차례의 수술을 필요로 하는 골수 등의 일반 간엽조직보다
훨씬 채취가 용이하고, 골수 이식에 비해 제대혈 보관산업
이 활성화되어 이미 인프라가 구축되어 있으므로 공여자
를 구하는 것도 용이하다.
이와 더불어, 제대혈 유래 세포는 조직이나 장기 이식에
서 거부반응을 일으키는 가장 중요한 원인인 조직적합
항원 HLA-DR (class II)이 발현되지 않는 세포이므로 (Le
Blanc, KC, Exp Hematol, 31:890-896, 2003; 및 Tse WT
et al., Transplantation, 75:389-397, 2003),
기존의 이식수술시 문제가 되었던 거부반응 등의 면역반
응을 유발하지 않거나 최소화할 수 있어, 자가유래 제대혈
은 물론 타가유래 제대혈 또한 사용할 수 있다.
제대혈을 채취 분리하는 방법은 다음과 같다.
제대혈 채취 단계에서는, 정상 질식분만의 경우에는 아기
출산 후 자궁 내에 아직 태반이 남아있는 상태에서 밖으로
만출된 제대정맥으로부터 채취하거나, 제왕절개의 경우
에는 아기 출산 후 태반 역시 자궁 밖으로 만출된 상태에
서 제대정맥으로부터 채취한다.
출산 후 자궁 밖으로 만출된 제대정맥으로부터 제대혈
을 채취할 때는, 신생아가 태어난 후 태반과 태아를 연결
하고 있던 제대정맥으로부터 무균적 조작법에 의해 채취
한다.
이때, 출산 후 자궁에서 태반박리가 일어나기 전에 제대혈
을 채취하거나, 또는 태반박리가 일어난 후 체외에서 제대
혈을 채취하는 두 가지 방법 모두 사용할 수 있다.
제왕절개의 경우에는 태반 박리가 일어난 후 체외에서
제대혈을 채취하는 방법을 사용하며, 제대정맥을 확보
한 후에 채취침을 이용하여 항응고제가 함유된 제대혈
채취백 (주머니)에 제대혈을 채취한다.
본 발명의 조성물은 상기 제대혈로부터 분리 또는 증식
된 세포, 바람직하게는, 제대혈로부터 분리되고 조혈모
세포 및 간엽줄기세포를 포함하는 단핵구 세포들, 제대
혈로부터 분리된 간엽줄기세포, 및 상기 간엽줄기세포
로부터 계대 배양에 의해 증식된 간엽줄기세포 중에서
선택된 하나 이상의 세포를 포함하며, 더욱 바람직하게
는, 제대혈로부터 분리된 간엽줄기세포 또는 이들로부
터 계대 배양에 의해 증식된 간엽줄기세포를 포함한다.
제대혈로부터 분리된 간엽줄기세포는 전형적인 골수의
간질세포 (stromal cells)와 달리 다능성 (multipotent)이므
로, 적절한 분화 조건 하에서 뼈, 연골, 지방조직, 근육,
건 등과 같은 간엽 조직으로 분화될 수 있다.
또한, 제대혈 유래 간엽줄기 세포는 자가복제 (self renewal
)하는 능력이 있으므로, 특정한 세포나 조직으로 분화되지
않으면서 적절한 조건하에서 증식이 가능하며, 이식시
항 염증 소견을 보일 수 있다.
이와 더불어, 골수, 근육, 피부 등의 일반 간엽조직으로
부터 분리된 간엽줄기세포에서 유래한 세포들에 비해,
더욱 어린 개체로부터 기원한 세포이므로 세포의 증식,
분화 및 조절물질 분비능력이 훨씬 우수하다.
채취된 제대혈로부터 간엽줄기세포를 분리ㆍ배양하는
방법으로는 대한민국 공개특허 제2003-0069115호의
방법을 비롯하여 당업계에 공지된 통상의 방법 (Pittinger
MF et al. Science, 284: 143-7, 1999; 및 Lazarus HM
et al. Bone Marrow Transplant, 16: 557-64, 1995)을
사용할 수 있으며, 그 중 한 예를 들면 다음과 같다.
먼저, 채취된 제대혈을, 예를 들어, 피콜-하이팩 농도
구배 (Ficoll-Hypaque gradient)를 이용하여 원심분리함
으로써 조혈모세포 및 간엽줄기세포를 포함하는 단핵구
세포들을 분리한 후, 여러 번 세척하여 이물질들을
제거한다.
세척 후 적절한 밀도로 단핵세포들을 배양용기에 심어
배양하면, 단일층을 이루면서 세포들이 증식하는데, 이
중 위상차 현미경으로 관찰되는 모양이 동질성 (homog
eneous)이면서, 방추형 모양 (spindle shape)의 긴 형태의
세포들의 집락 (colony) 형태로 증식하는 세포가 간엽줄
기세포이다. 이후 세포가 배양되어 자라게 되면 계대배양
을 실시하여, 필요한 만큼의 세포수가 될 때까지 증식
시킨다.
본 발명의 조성물에 포함되는 세포는 냉동보관할 수 있
으며, 이는 공지된 방법에 따라 수행될 수 있다 (Doyle et
al.,1995).
냉동시 사용되는 배지의 조성은 10∼20% FBS (fetal bovine serum) 및 10% DMSO (dimethylsulfoxide)로 구성되며, 상기
배지 1㎖에 약 1×106∼5×106개의 세포가 존재하도록
세포를 현탁한다.
상기 세포 현탁액을 저온냉동용의 유리 또는 플라스틱
재질의 앰플에 분배하고, 이를 봉하여 미리 온도 조건이
맞춰진 프로그램 냉동기에 넣는다. 세포를 냉동시킬 때는
, -1℃/분의 온도 변화를 제공하는 냉동 프로그램을 이용
하는 것이 이후 해동시 세포 손상을 줄일 수 있어 바람직
하며, 일단 앰플의 온도가 -90℃ 이하에 도달하면, -150℃
이하의 액체 질소 저장 탱크로 이동시킨다.
냉동 보관된 세포를 해동시킬 때는, 앰플을 액체 질소
저장 탱크로부터 신속하게 37℃로 조절된 수조로 이동
시킨다.
앰플안에 해동된 내용물은 멸균 상태 하에서 배양 배지가
들어 있는 배양 용기에 즉각 옮기는 것이 바람직하다.
본 발명에서 간엽줄기세포의 분리·배양에 사용가능한 배양
배지로는 10% 내지 30% FBS를 포함하는 세포 배양용
배지를 사용할 수 있으며, 세포 배양용 배지로는 DMEM,
MEM 배지를 비롯하여 α-MEM, McCoys 5A 배지, 이글스
기본 배지 (eagle's basal medium), CMRL 배지, 글래스고우 (Glasgow) 최소 필수 배지, (Ham's) F-12 배지, IMDM (Isco
ve's modified Dulbecco's medium), 리보비츠 (Liebovitz')
L-15 배지, RPMI 1640 배지 등 당업계에서 통상적으로
사용되는 세포배양용 배지는 모두 사용가능하며, DMEM
배지를 사용하는 것이 바람직하다.
배양시에는 상기 배지 1 ㎖에 약 5×103∼2×104개의 세포
가 존재하도록 세포를 현탁한다.
또한, 상기 세포 배양 배지에는 필요에 따라 한 가지 이상
의 보조성분을 첨가할 수 있는데, 이러한 보조성분으로는
태아 송아지, 말 또는 사람 등의 혈청을 비롯하여, 미생물
의 오염을 막기 위한 페니실린 G (Penicillin G), 스트렙토
마이신 설페이트 (streptomycin sulfate) 및 젠타마이신 (gentamycin) 등의 항생제, 암포테리신 B (amphotericin B)
및 니스타틴 (nystatin) 등의 항진균제 (antifungal agent) 및
이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 성분 중 하나
이상을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는, 상기와 같이 채취된 제대혈을
원심분리하여 단핵세포들을 분리하고, 적절한 밀도로
배양용기에 심어 배양한 후, 적정 밀도에 달하면 계대배양
하여 세포를 증식시켰다.
한편, 신생 백서에 출생 직후 고농도 산소를 지속적으로
투여하여 기관지 폐 이형성증 모델을 제작하였다.
그 결과, 기관지 폐 이형성증이 유발된 백서들은 호흡수
가 매우 증가하며 체중이 잘 늘지 않았고, 폐를 적출하여
염색한 후 관찰한 결과 (HC), 단핵구 증가가 동반되는 만성
염증성 반응과 간질 섬유아세포의 과다 증식이 동반되는
섬유화가 진행되었다 (도 1b 및 도 2).
이와 더불어, 상기 백서들의 폐 조직(HC)은 정상 백서의
폐 조직 (NC)에 비해 폐포의 수를 나타내는 방사상 폐포
수 (radial alveolar count, RAC; Husain AN et al., Pediatr
Pathol., 13:475-484, 1993 참조)가 현저하게 감소하며,
폐포의 크기를 나타내는 평균 선상 구분 (mean linear inter
cept, MLI; Dunnill MS., Thorax 17:320-328, 1962 참조)과
평균 폐포 용적 (mean alveolar volume, McGowan S et al.
, Am J Respir Cell Mol Biol., 23:162-167, 2000 참조) 측정
치는 현저하게 증가하여 (도 3a 내지 3c), 폐포 발달의 현저
한 이상소견을 보였다.
반면에, 본 발명의 조성물을 기도 내 투여한 백서의 폐
조직 (HT)에서는 손상이 완화되고 (도 1c 및 도 2), RAC가
증가하고 MLI 및 평균 폐포 용적이 감소함을 관찰하였다
(도 3a 내지 3c).
또한, 호중구 축적의 지표인 골수세포형 과산화효소 (myeloperoxidase, MPO)를 측정한 결과, 고농도 산소에
노출된 신생 백서의 폐 조직 (HC)에서 MPO 활성은 실내
공기에 노출된 동물에 비해 상당히 증가한 반면, 본 발명
의 조성물을 기도내 투여한 백서의 폐 조직 (HT)에서는
고농도에 노출된 백서에 비해 MPO 활성이 현저히 감소
하여 (도 4), 염증세포인 호중구 세포의 축적이 의미있게
줄어듬을 확인하였다.
한편, 적색 형광을 띠는 PKH26으로 표지된 세포를 포함
하는 본 발명의 조성물을 기도 내 이식한 백서의 폐 조직
을 형광 현미경으로 관찰하였을 때, 조성물 내의 세포가
폐에 안착된 것을 확인하였고 (도 5), 안착된 세포의 일부
가 폐 실질 세포로 분화됨을 확인하였다 (도 6).
따라서, 본 발명의 제대혈로부터 분리 또는 증식된 세포
는 성인의 낭포성 섬유증 (cystic fibrosis), 폐 기종 (emphy
sema) 등과 같은 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive
lung disease, COPD) 및 신생아 및 미숙아의 기관지 폐
이형성증 (bronchopulmonary dysplasia) 등을 포함하는
발달성, 만성 폐질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
제대혈로부터 분리 또는 증식된 세포를 유효성분으로
포함하는 본 발명의 발달성, 만성 폐질환 치료용 조성물
은 세포를 현탁하기 위한 배지, 폐질환 치료에 효과적인
유전자 (예: 항-염증성 사이토카인 (anti-inflammatory
cytokine) 유전자, 염증성 사이토카인 (inflammatory cyto
kine)에 대한 siRNA 또는 안티-센스 프라이머 (anti-sense primer)) 또는 이를 포함하는 발현벡터, 자가분비 (autocrine
) 또는 측분비 (paracrine) 효과를 제공하는 사이토카인 (예
: 인터루킨 (interleukin)
-10), 성장인자 (growth factor) (예: 케라틴 형성 세포 성장
인자 (Keratinocyte growth factor)), 및 이들의 조합으로 이
루어진 군에서 선택된 보조성분을 하나 이상 추가로 포함
할 수 있다.
이 때, 배지는 상기 배양용 배지와 동일한 종류의 배지일
수 있으며, 혈청, 항생제 및 항진균제는 전혀 포함하지
않는다.
상기 유전자 또는 이를 포함하는 발현벡터는 당업계에
공지된 방법, 예를 들어 바이러스성 형질감염 또는 비-바
이러스 기반 기법 등을 이용하여 본 발명의 세포에 전달되
거나, 상기 세포와 단순히 조합될 수 있다. 이때, 유전자의
도입은 아데노 바이러스성 형질전환, 유전자 총, 리포좀
-매개 형질전환 및 레트로바이러스 또는 렌티바이러스-
매개 형질전환, 플라스미드, 아데노-부속 바이러스를 포함
하나 이에 한정되지 않는 당업자에게 공지된 임의의 기법
에 의해 수행될 수 있다.
또한,상기 세포는 유전자를 장시간에 걸쳐 세포에 방출 또
는 전달할 수 있는 유전자 전달 매체를 지니는 담체 물질
과 함께 이식될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 1㎖ 당 1.0×105개 내지 1.0×
109개, 바람직하게는 1.0×106개 내지 1.0×108개, 보다
바람직하게는 1.0×107개의 세포를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 동결되지 않은채 사용되거나 차후
사용을 위해 동결될 수 있다.
동결되어야 할 경우, 표준 냉동보존제
(예를 들어 DMSO, 글리세롤, 에피라이프 (Epilife?) 세포
동결 배지 (Cascade Biologics))가 동결 전 세포 집단에
첨가될수 있다.
또한, 상기 조성물은 약학적 분야에서 통상의 방법에 따라
환자의 신체 내 투여에 적합한 단위투여형의 제제로 제형
화시켜 투여할 수 있으며, 상기 제제는 1회 또는 수회 투여
에 의해 폐포를 발달시킬 수 있는 효과적인 투여량을 포함
한다.
이러한 목적에 적합한 제형으로는 비경구투여 제제로서
주사용 앰플과 같은 주사제, 주입 백과 같은 주입제, 및
에어로졸 제제와 같은 분무제 등이 바람직하다.
상기 주사용 앰플은 사용 직전에 주사액과 혼합 조제할 수
있으며, 주사액으로는 생리 식염수, 포도당, 만니톨, 링거
액 등을 사용할 수 있다.
또한, 주입 백은 염화폴리비닐 또는 폴리에틸렌 재질의
것을 사용할 수 있으며, 박스터 (Baxter), 벡톤 디킨슨 (Be
cton Dickinson), 메드셉 (Medcep), 내셔날 호스피탈 프로
덕츠 (National Hospital Products) 또는 테루모 (Terumo) 사
의 주입 백을 예시할 수 있다.
상기 약학적 제제에는 상기 유효성분 외에 하나 또는 그
이상의 약학적으로 허용가능한 통상의 불활성 담체, 예를
들어, 주사제의 경우에는 보존제, 무통화제, 가용화제 또는
안정화제 등을, 국소 투여용 제제의 경우에는 기제 (base),
부형제, 윤활제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
이렇게 제조된 본 발명의 조성물 또는 약학적 제제는 당업
계에서 통상적으로 사용하는 투여방법을 이용하여 이식
및 기타 용도에 사용되는 다른 줄기세포와 함께 또는 그러한 줄기세포와의 혼합물의 형태로 투여될 수 있으며, 바람직
하게는 치료가 필요한 환자의 폐질환 부위에 직접 생착
또는 이식하거나 기도에 직접 이식 또는 주입하는 것이
가능하나 이에 한정되지는 않는다.
또한, 상기 투여는 카테터를 이용한 비외과적 투여 및 흉부
절개 후 주입 또는 이식 등 외과적 투여방법 모두가능하
나 카테터를 이용한 비외과적 투여방법이 보다 바람직하다.
또한 통상의 방법에 따라 비경구적으로, 예를 들면 직접
병변에 투여하는 것 외에 조혈계 줄기세포 이식의 일반적
방법인 혈관 내 주입에 의한 이식도 가능하다.
상기 제대혈로부터 분리 또는 증식된 세포의 1일 투여량
은 1.0×104 내지 1.0×1010 세포/kg 체중, 바람직하게는
1.0×105 내지 1.0×109 세포/kg 체중을 1회 또는 수회로
나누어 투여할 수 있다.
그러나, 유효성분의 실제 투여량은 치료 하고자 하는 질환,
질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등
의 여러 관련 인자에 비추어 결정되어야 하는 것으로 이해
되어야 하며, 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본
발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명에서는 또한 제대혈로부터 분리 또는 증식된 세포
를 유효성분으로 포함하는 상기 조성물을 이용하여 발달
성, 만성 폐질환을 치료하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 조성물 또는 약학적 제제를 상기에 기재
된 바와 같은 다양한 방법으로 환자에게 투여하는 단계
를 포함한다.
이러한 본 발명의 발달성, 만성 폐질환의 치료방법은 바람
직하게는 기도 내 투여 방식을 이용하여 폐 조직에 가까이
투여함으로서 기존의 혈관 정주를 통한 세포이식방법에
비해 접근성을 높여 치료 효과를 높일 수 있다.
또한, 제대혈은 출산 시 자연적으로 발생하는 부산물이
므로 여러 차례의 수술을 필요로 하는 골수 등의 일반간엽
조직보다 훨씬 채취가 용이하고, 골수 이식에 비해 보관
산업이 활성화되어 이미 인프라가 구축되어 있으므로 공여
자를 구하는 것도 용이하다.
또한, 조직이나 장기 이식에서 거부반응을 일으키는 가장
중요한 원인인 조직적합항원 HLA-DR (class II)이 발현되지
않는 세포이므로, 기존의 이식수술시 문제가 되는 거부
반응 등의 면역반응을 유발하지 않거나 최소화할 수 있어
, 자가유래 제대혈은 물론 타가유래 제대혈 또한 사용할
수 있다.
(메디의 제대혈 제품은 거부반응이 거의 없는것이 최고의
장점이 될것입니다
물론 완치율도 높은것도 큰 장점이 될것입니다)
상기와 같은 장점으로 인해, 본 발명의 방법을 사용하면
성인의 낭포성 섬유증 만성 폐쇄성 폐질환 및 기관지 폐
이형성증 등을 포함하는 발달성, 만성 폐질환을 효과적
으로 치료할 수 있다.
(뉴모스템이 상품승인후 판매가 된다면 효과는 물론 시장
성도 클것입니다)
이하, 실시예에 의해 본 발명을 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은
아니다.
(밑의 <실시예>는 실험을 하는 과정을 기록한것입니다
여러분들도 상상을 동원하여 과학자가 되어서 실험을 한
다고 생각하면 이해가 쉬울것입니다
오늘 공부는 다같이 실습을 해 볼까요 )
<실시예 1> 세포의 분리·배양
본 발명의 치료용 세포, 즉 간엽줄기세포 (Mesenchymal
stem cells)를 다음과 같이 인간 제대혈로부터 분리ㆍ배양
하였다 (Yang SE et al., Cytotherapy, 6(5):476-86, 2004).
<1-1> 제대혈 (umbilical cord blood, UCB) 수득
제대혈 샘플은 산모의 동의를 얻어 출산시 제대정맥 (umb
ilical vein)으로부터 수득하였다.
구체적으로, 23 또는 44.8 ㎖의 CPDA-1 항응고제 (녹십
자, 한국)를 포함하는 UCB 수집함 (collection bag)의 16-
게이지의 주사바늘을 제대정맥에 삽입하여 UCB가 중력
에 의해 수집함으로 모이도록 하였다.
모든 제대혈 수득물은 수집 후 48시간 내에 처리하였으
며, 단핵구 세포의 생존율은 90% 이상이었다.
(생존율도 90% 이상이라면 높은편이군요)
<1-2> 간엽줄기세포의 분리 및 증식
상기 <1-1>에서 얻은 제대혈 수득물을 피콜-하이팩 농도
구배 (Ficoll-Hypaque gradient, 밀도 1.077 g/cm3, Sigma,
미국)로 원심분리하여 단핵구 세포를 수득한 다음, 기본
배양배지 (10% FBS (HyClone, 미국)가 첨가된 최소 기본
배지 α- MEM (Gibco BRL, 미국))로 수 차례 세척 후 기본
배양배지에 5×106 세포/㎠의 농도로 접종하여 현탁하였다
. 이를 37℃, 5% CO2를 포함하는 습윤한 대기에서 일주일
에 두번씩 배지를 교환해가며 배양하였으며, 배양 후 섬
유아세포와 유사한 부착력있는 세포가 관찰되었다.
3 주 이내에 간엽줄기세포 콜로니의 단일층에 0.25% 트
립신 (HyClone)을 처리하고 세척한 다음, 기본 배양배지에 5×104 세포/㎠의 농도로 접종하고 현탁하는 계대 배양을
반복함으로써 체외 (ex vivo) 증식에 의해 수를 증가시켰다.
<실시예 2> 고농도 산소주입-기관지 폐 이형성증 모델
모든 동물실험은 삼성생명과학연구소 실험동물위원회 (Research Animal Laboratory Committee of Samsung
Biomedical Research Institute, Korea)에 의해 승인을 받았
고 기관의 가이드라인을 따랐다.
먼저, 기관지 폐 이형성증 모델을 만들기 위해, 재태기간
을 정확히 알 수 있는 임신된 스프래그 돌리 백서 (대한
바이오링크)를 구입한 후 실험동물 사육시설에서 출산
전 적어도 1주 이상 사육하였다.
이로부터 태어난 신생 백서에게 출생 직후 (출산후 10시간
내)부터 고농도 산소를 14일간 투여하였다.
구체적으로, 69.5×50.0×32.0㎝ 크기의 아크릴 통 (밀폐된 Plexiglas 케이지)에 어미 쥐와 새끼 쥐가 든 케이지를 넣고
1기압 하에서 충분한 습도 (40-60%)와 온도 (23-26℃)를
유지하면서 100% 산소를 처음 10분간 10 ℓ/분의 속도로
주입하여 포화시킨 다음, 산소농도 분석기 (모델명: 572, Servomex, 미국)로 측정하여 95% 이상 산소포화도가 달
성되면, 이후100% 산소를 2.5 ℓ/분의 속도로 관류시키면
서 산소 포화도를 계속 측정하여 95% 정도가 유지되도록
하였다.
어미 쥐의 산소 독성으로 인한 폐부종을 막기 위하여 24
시간을 주기로 어미 쥐를 실내 공기 또는 95% 산소 조건
으로 이동시키면서 14일간 계속 사육하였다.
<실시예 3> 제대혈 간엽줄기세포 투여
상기 실시예 2에서 고농도 산소에 노출시킨 출생 5일째
백서에, 목의 중앙부위에서 공기의 역류를 확인한 후, 상
기 실시예 1에서 수득한 제대혈 간엽줄기세포를 FBS가
첨가되지 않은 α-MEM에 현탁시킨 현탁액 0.05 ㎖ (5.83
×105 세포 포함)를 26 게이지 바늘을 이용하여 기도 내로
투여하였다.
<실시예 4> 동물 희생 후 조직 준비
실험 14일째 신생 백서에게 펜토바르비탈을 복강 내 주사
하여 마취를 시행한 후, 사지 고정 후 흉곽을 절개하여
심장과 폐 조직을 드러나게 하였다.
이 중 일부의 백서는 빙냉 PBS 용액으로 심장관류를
실시한 다음 심장과 폐를 함께 적출하고, 기관지로 관을
넣고 단단히 고정시키고 4% 포름알데하이드 고정액을
넣어 25 ㎝ H2O의 압력으로 일정하게 부풀린 다음, 밤새
동일 고정액으로 고정하였다.
또한, 나머지 백서들에서 폐를 적출한 다음, 폐 조직을
바로 액체질소에 동결시켰다.
<실시예 5> 섬유화 정도, RAC, MLI 및 평균 페포 용적 측정
상기 실시예 4에서 4% 포름알데하이드에 24시간 동안 고정
시킨 폐 조직의 절편을 파라핀에 포매시킨 후, 4 ㎛의 두께로
잘라 헤마톡시린 에오신으로 염색하고 광학현미경 하에서
관찰하여 중성 백혈구 (neutrophils)의 수, 섬유화의 정도
및 폐포 중격 및 폐간질의 세포수, 두께 증가 정도 및 폐
부종 유무를 확인한 다음, 새로 형성되는 낭과 폐포를 반영
하는 방사상 폐포 수 (RAC)와 폐포의 크기를 측정하는
평균 선상 구분 (MLI)을 측정하였으며, 평균 폐포 용적을
계산하였다.
이 중 섬유화 정도의 정량은 Stocker의 방법 (Stocker, J.T
, Hum Pathol., 17:943-961, 1986 참조)을 약간 변형하여,
마리당 겹치지 않는 6개의 폐 단면 (section)을 무작위로
골라 1 단면당 5개의 폐 필드, 즉 총 30 폐 필드를 10배
의 배율에서 관찰하여, 각각의 폐 필드에서 섬유화 정도
가 없으면 0점, 약간의 폐포 중격 섬유화 소견이 관찰되면
1점, 중등도로 관찰되면 2점, 아주 심한 경우를 3점으로
점수화하여 평균하였다.
RAC (Husain AN et al., Pediatr Pathol., 13:475-484, 1993
참조)는 말단 세기관지에서 가장 가까운 유관속 중격
(fibrovascular septum)까지 수직의 선을 긋고 그 사이의 모든
낭포 (saccule)의 개수를 측정하였다.
MLI (Dunnill MS., Thorax 17:320-328, 1962 참조)는 광학
현미경의 40 배율에서 조직을 관찰하면서, 1 ㎜ 자를 이용하
여 그 사이에 걸쳐지는 격막 (septum)의 개수를 측정하여
계산하였다.
RAC 및 MLI는 현미경으로 무작위 부위를 각각 10회씩 검사
하였다.
평균 폐포 용적 (McGowan S et al., Am J Respir Cell Mol Biol., 23:162-167, 2000 참조)은 200배로 확대된 폐 원위부
단면 사진에 크로스가 균일하게 그어진 그리드 (grid)를 대고
크로스가 포함된 폐포의 지름을 측정하여 그 지름의 세제곱
값에 π를 곱한 후 3으로 나누어 구했으며, 마리당 무작위로
6장씩을 재어 계산한 후 평균값을 구하였다.
각각에 대해 이들의 평균치로 통계적 분석을 수행하였다.
각 절편의 이미지는 Olympus BX81 현미경을 통해 디지털
카메라로 촬영하였다.
데이터는 평균±SD로 나타내었는데 통계적 분석은 SAS (enterprise guide version of three, SAS Institute, 미국)를
사용하여, ANOVA (analysis of variance)에 이은 Mann Whitney 검정 또는 Kruska Wallis 검정을 실시하였다 (0.05 이하의
모든 p 값은 유의한 것으로 간주하였다).
그 결과, 기관지 폐 이형성증이 유도된 백서의 폐 조직 (HC)
에서는 폐포 대식세포와 임파구 등의 단핵구의 증가가 동반
되는 만성 염증성 반응과 간질 섬유아세포의 과다 증식이
동반되는 섬유화 소견이 진행되었으나, 간엽줄기세포를
기도 내 투여한 백서의 폐 조직 (HT)에서는 병리학적 소견
상 손상이 유의하게 완화되었고 (도 1a 내지 1c), 섬유화
정도의 정량에서도 이러한 소견은 뚜렷하였다 (도 2).
또한, 기관지 폐 이형성증이 유도된 백서의 폐 조직 (HC)
에서는 정상 백서의 폐 조직 (NC)에 비해 RAC가 현저하게
감소되고, MLI 및 평균 폐포 용적은 현저하게 증가하여
폐포수가 적어지고 그 크기가 비정상적으로 커지는 폐포
발달 장애가 뚜렷하였다.
그러나, 간엽줄기세포를 기관내로 투여한 백서의 폐 조직
(HT)에서는 기관지 폐 이형성증만이 유도된 백서의 폐
조직 (HC)에 비해 RAC 값이 증가하고 MLI 값과 평균 폐포
용적 값이 감소하여 (도 3a 내지 3c), 폐포의 크기가 작아
지고 폐포의 수가 증가하여 폐포 발달 정도가 뚜렷하게 향
상됨이 증명되었다.
<실시예 6> MPO (myeloperoxidase) 활성
호중구 축적의 지표인 골수세포형 과산화효소 (myeloperoxidase, MPO)의 활성은 Gray 등 (Gray KD et al.
Am J Surg., 186:526-530, 2003)의 방법을 변형하여 측정
하였다.
구체적으로, 액체질소에 동결되었던 폐 조직을 인산염 완
충용액 (pH 7.4)에서 균질화시킨 후 30,000×g으로 30분간
원심 분리한 후, 펠렛을 0.5% 헥사데실트리메틸 암모늄
브롬화물이 첨가된 다른 인산염 완충용액 (50 mM, pH 6.0)에 재현탁하였다.
재현탁한 펠렛에서 MPO 활성은 0.167 ㎎/㎖ O-디아니시딘
하이드로클로라이드와 0.0005 % 과산화수소를 이용하여
460 ㎚에서 흡광도 변화를 측정하여 확인하였고, MPO 활성
1 유닛 (unit)은 1 μmol 의 페록사이드를 1분에 분해하는
효소의 양으로 정의하였다.
데이터는 평균±SD로 나타내었으며 통계적 분석은 실시예
5와 동일한 방법으로 실시하였다 (0.05 이하의 모든 p 값은
유의한 것으로 간주하였다).
MPO 활성 측정 결과, 고농도 산소에 노출된 신생 백서의
폐 조직 (HC)에서 MPO 활성은 실내 공기에 노출된 동물에
비해 상당히 증가하여 염증 세포인 호중구 세포의 축적이
의미있게 증가함을 알 수 있었다.
그러나, 간엽줄기세포를 기도 내로투여한 경우 (HT)에는
고농도 산소에 노출된 백서에 비해 MPO 활성이 현저히
감소하여 (도 4), 염증세포인 호중구 세포의 축적이 의미
있게 줄어듬을 알 수 있었다.
<실시예 7> 이중 표지 면역형광조직화학 염색
폐에 이식된 간엽줄기세포가 이식 후 어떻게 분화되는지
알아보기 위하여 현미경 관찰을 실시하였다.
우선, 폐에 간엽줄기세포가 잘 이식되었는지를 확인하기
위하여, 적색 형광을 띠는 PKH26 (시그마, 미국)으로 표지
된 실시예 1의 간엽줄기세포를 기도 내로 이식한 기관지
폐 이형성증 백서의 동결 폐 조직을 형광 현미경으로 관찰
하였다.
그 결과, 실시예 1의 간엽줄기세포가 폐에 안착된 소견을
관찰할 수 있었다 (도 5).
또한, 폐에 안착된 세포의 분화 성상을 알아보기 위하여,
세포 특이적인 마커에 대해 면역형광조직화학 염색으로
동결 조직 절편을 검사함으로써, PKH 26으로 표지된 이식
된 세포가 폐 실질 세포의 일종인 2형 폐 세포의 특이 마
커인 pro SP-C (pro surfactant protein C)와 함께 염색되는
지 알아보았다.
구체적으로, 동결 폐 절편을 4% 파라포름알데하이드로 30분 동안 고정하고 1% 우혈청 알부민과 0.1% 트리톤 (Triton)
X-100 혼합액에 30분간 추가 처리한 후, 0.1% TritonX-100과 3% 정상 염소 혈청이 혼합된 PBS로 1시간 동안 상온에서
블로킹하였다.
이후, 1차 항체인 pro SP-C (토끼 다중클론, Sterologicals
Co., 미국)를 1:100으로 희석한 후, 절편과 함께 4℃에서
밤새 방치하였다.
이를 PBS로 세척하고 블로킹 용액에서 1 시간 동안 Alexa Fluor 488 염소 항-마우스 (1:500, Molecular Probes, 미국)
2차 항체와 함께 방치하였다.
이후, DAPI (4'-6-Diamidino-2-phenylindole, Molecular probes, 미국)로 대조 염색 (counter staining)하고 벡터 쉴드 (Vector shield, Vector Laboratories, 미국)를
이용하여 마운팅한 후, 공초점 이미징 현미경 (confocal imaging microscopy, Bio
Rad, 미국)을 사용하여 확인하였다.
형광사진은 Olympus EX41 형광 현미경 (Olympus, 미국)
으로 촬영하였다 (Olympus MaganFire 카메라 X100 및 X40
렌즈 사용).
그 결과, 간엽줄기세포가 투여되지 않은 대조군 백서의 폐
조직은 최소의 기본 염색만을 나타내었고 간엽줄기세포를
기관 내로 투여받은 백서의 폐에서는 다수의 PKH26 표지
인 적색 형광을 띤 주입 세포가 관찰되었다.
또한, 폐 실질세포인 2형 폐 세포의 마커인 pro SP-C를
녹색 형광으로 표지하여 동시 염색을 실시한 결과, 안착된
세포 일부에서 동시 표지가 관찰됨으로서, 이식되어 백서
의 폐 조직에 안착된 간엽줄기세포의 일부가 폐 실질 세포
로 분화됨을 알 수 있었다 (도 6).
따라서, 본 발명의 치료용 조성물을 기도 내에 투여하면
만성 발달성, 폐질환을 효과적으로 치료할 수 있음을 알
수 있다.
(실시예를 통해서 메디의 뉴모스템이 어떻게 연구되는지를
일부분 이해가 됬을것입니다
메디의 연구실은 지금도 날새기를 밥먹다시피 하면서 기존 특허에 또다른 새로운 연구가 진행중인것으로 알고 있습니다)
발달성, 만성 폐질환 치료용 조성물은 치료가 필요한 기도
내직접 투여 방식을 이용하여 폐 조직에 가까이 투여됨으
로서 접근성을 높여 치료 효과를 높일 수 있으므로, 발달
성, 만성 폐질환의 치료에 매우 유용하다.
ㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡ
저는 메디의 특허를 공부하면서 주가와 관계없이 마음이
편합니다
안타까운것은 돈이 없어서 추가로 매수하지 못하는 안타까
움은 있지만 메디의 기술력은 미래의 어떤 기업보다 앞설
갈것이란 확신을 들게 합니다
다른것은 몰라도 특허공부만은 몇번씩이라도 읽어서 이해
하시기를 바랍니다
메디에 대한 확신은 공부를 하다보면 저처럼 확신이 들고
장기투자에 대한 이해가 될것입니다
메디랑 형제중에는 제가 알기로 의사분들이나 의료계에
종사하신분과 그사람님처럼 의학상식이 많은분이나
선정형외과 푸른심장이란 닉을 쓰는 김실장님과 제가
자랑스럽게 생각하고 존경하는 dhleephd 선배님등 이
계십니다
그러므로 모르는 부분에 대해서는 질문을 제가쓴글 밑에
댓글로 달아 주시면 될것입니다
제가 모르는부분은 이분들이 답해 줄것입니다
그전에 보니까 "주성" 이 무엇이냐고 묻는분이 계시는데
주성이란 주 성분이란 뜻일것입니다
( 주성이란 유래간엽줄기세포의 유주활성을 유도하는것이
주성입니다)