Re:근 디스트로피에 대한 새로운 유전자 치료(일본경제신문·게재) 에 임해서

[운강 정초근]

듀센느 형 근 디스트로피에 대한 분자 치료의 시도

타케다 신이치 , 요시무라 창문이나

국립 정신·신경 센터 신경 연구소 유전자 질환 치료 연구부
e-mail address; takeda@ncnp.go.jp">takeda@ncnp.go.jp

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　목차：

　　　요약

　　　1.　바이러스 벡터를 이용한 유전자 치료

　　　2.　재생 이식 치료

　　　3.　약물 치료

　　　끝에

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요약：

　근 디스트로피란 , 진행성에 근육이 괴사·변성해 , 근력이 없어져 가는 병의 총칭입니다. 듀센느 형 근 디스트로피(DMD) 는 가장 빈도의 높은 근 디스트로피입니다. 대부분이 남아에만 발병합니다만 , 그 비율은 남아 출생약3300인에 한 명이라고 말해지고 있습니다.
　남성에게는1개 , 여성에게는 두 개 있는 , 성 염색체인X염색체상에는 , 근육의 세포(줄기 세포) 의 뼈대(세포 골격) 를 만드는 지스트로핀이라고 하는 단백의 유전자가 있습니다. 유전자의 비정상이어 , 지스트로핀이 거의 만들 수 없게 되는 것이DMD입니다.

　지스트로핀은 줄기 세포의 골격을 유지하고 있으므로 ,DMD그럼 줄기 세포가 그 형태를 유지할 수 없게 되어 , 용이하게 망가지게 됩니다. 그 결과 , 줄기 세포는 붕괴·재생을 반복해 , 근육으로서의 기능을 할 수 없게 되어 , 근력 저하 , 줄기 위축을 초래합니다. DMD의 증상은 유아기의 기립·보행 장해로부터 시작되어 ,10나이 전후로 걸을 수가 없게 됩니다. 근력 저하에 의한 호흡 장해나 , 같은 근육으로 되어있는 심장의 기능 장해가 사인이 되는 것이 많아 , 환자분은20나이 정도로 사망되는 것이 많았습니다만 , 최근에는 의료 기구나 약물등의 의학의 진보에 의해30다이 ,40다이까지 생존되는 환자분도 계(오)십니다.

　유감스럽지만 , 이 병의 근본적인 치료법은 아직 발견되고 있지 않습니다. 그러나 최근 , 분자생물학의 진보에 의해 여러가지 기술이 치료에 응용할 수 있게 되어 , 더해 근육의 구조나 기능 , 병의 과정이 해명되어 완전히 새로운 치료법이 고안 되게 되었습니다.

　우리는DMD의 근치 요법을 위한 몇개의 분자 치료를 고안 , 실현을 향한 실험을 진행시키고 있습니다. 여러분 에게 , 우리가 가고 있는 연구를 중심으로 , 근 디스트로피 치료의 장래에의 전망을 소개하고 싶다고 생각합니다.

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1. 바이러스 벡터를 이용한 유전자 치료

　우선 우리는 , 환자분의 근육에 결손하고 있는 지스트로핀 단백을 만들 수 있도록(듯이) 하는 치료를 검토하고 있습니다.
　
　DMD의 환자분의 지스트로핀 유전자는 정상적인 지스트로핀 단백을 만들 수 없기 때문에 , 지스트로핀 단백을 만들 수 있는 것 같은 유전자를 보충하면 좋은 것입니다. 문제는 , 어떻게 유전자를 보충할까 (유전자 도입법) 입니다. 많은 근육에 제일 효율적으로 도입하기 위해서는 , 자연계에 존재하는 바이러스를 안전한 것에 개조해 사용할 방법이 일반적입니다. 여러가지 바이러스가 벡터(유전자를 핵안에 도입하기 위한 도구를 이렇게 부르고 있습니다 ) 로서 사용되고 있습니다만 , 우리는 아데노수반 바이러스(adeno-associated virus,AAV라고 생략합니다 )라고 하는 , 사람에 대해서 병을 일으키게 할리가 없는 무해인 바이러스를 벡터에 이용하고 있습니다 (그림1).

그림1.AAV벡터를 이용한 근육에의 유전자 도입(모식도)

　여기에서는 근육에의 마이크로지스트로핀 도입을 예로서 모식화했다. 도입 유전자(빨강 실선) 를 가지는AAV벡터는 줄기 세포 표면의 수용체에 결합해 , 세포내에 받아들여지고 핵으로 이행한다. 핵으로 도입 유전자는 번역되고 마이크로지스트로핀(파선) 이 세포막에 발현한다. AAV벡터의 줄기 세포막의 수용체는 바이러스의 혈청형으로 달라 , 헤파린 황산이나 시알산등의 세포 표면 단백이다고 생각되고 있다.

　
AAV(은)는 , 통상의 바이러스로 발생하는 염색체에의 편입이 거의 없는 것(이것은 , 짜넣어진 유전자가 다른 정상적인 기능을 해치거나 암이나 백혈병을 일으키거나 혹은 불필요하게 자손에게 유전하는 위험이 없다고 말하는 것입니다 ) 과 효과가 지속하는 것으로 ,DMD(을)를 시작으로 한 다양한 질환에의 실용화가 기대되고 있습니다.

　그러나DMD에의 치료로서 실용화하려면 몇개인가 문제가 있었습니다. 하나는 , 지스트로핀 유전자 전부를 옮길 수 없다고 하는 문제입니다. 지스트로핀 유전자는 전체 길이가14Kb라고 하는 길이입니다만 ,AAV이 옮길 수 있는 크기는4.7Kb까지 입니다 (kb라고 하는 것은 유전자의 길이를 나타내는 단위입니다. 유전자 배열을 결정하는 핵산의 한 벌을1bp, 1000bp로1kb라고 말합니다 ). AAV에 한정하지 않고 , 지스트로핀 유전자의 전체 길이를 벡터에 옮기게 하는 (짜넣는다 , 라고 말합니다 ) 것 은 너무 커 몹시 어렵습니다.

　그런데 , 우리는 지스트로핀 유전자의 , 필요 불가결한 부분만큼을 사용하는 것을 세계에서 처음으로 생각이 떠올랐습니다. 지스트로핀 유전자의 두측(5＇옆；번역이 시작되는 부분) 과 꼬리측은 중요한 기능이 있는 것을 알 수 있고 있기 (위해)때문에 , 한가운데의 부분을 깎지 않으면 안됩니다.

　한가운데의 부분 가운데, 너무 중요하지 않은 장소는 어딘가라고 생각했을 때 , 어느Becker형태 근 디스트로피(BMD) 의 환자분의 지스트로핀 유전자가 힌트가 되었습니다. BMD(은)는 ,DMD과 같이 완전히 지스트로핀을 할 수 없는 것은 아니고 , 불완전한 지스트로핀 단백이 되어있습니다 (자세한 것은 , 야중 선생님의 페이지를 참고로 합시다→http://www.ncnp.go.jp/hospital/news/kin210.htm).

　BMD의 환자분으로 , 증상이 거의 눈에 띄지 않는데 지스트로핀 유전자의 한가운데의 부분이 크게 빠져 있는 사람이 발견되었습니다. 그 환자분의 지스트로핀 유전자는 , 정상적인 것은14Kb의 정상 지스트로핀에 대해서 ,6.4Kb라고 하는 길이인 것을 알 수 있었습니다. 즉 , 이 환자분이 가지고 있던 짧은 지스트로핀 단백은 거의 정상적인 기능이 남아 있었습니다. 이6.4Kb의 , “미니지스트로핀”유전자만 도입할 수 있으면 ,DMD의 무거운 증상으로는 면할 수 있을 것이라고 우리는 생각했습니다.

　그러나 , 벡터에 짜넣으려면 이 유전자에서도 너무 컸으므로 , 한층 더 한가운데나 구석을 깎아 ,4.7Kb이하의 단축형 지스트로핀(이하“마이크로지스트로핀”이라고 부릅니다 ) 을 만들었습니다 (그림2).

그림2.듀센느 형 근 디스트로피의 유전자 치료에 이용되는 유전자의 구조

　전체 길이형 지스트로핀 유전자는14 kb과 장대하고 , 매우 경증의Becker형태 근 디스트로피로부터 찾아내진 미니지스트로핀 유전자로 해도6.4 kb있다. 우리는 지스트로핀 유전자 중 엑틴 결합 부위 , 시스테인릿치드메인 ,C말단을 유지한 채로 , 중앙의 라드 도메인을 단축해 , 아데노수반 바이러스(AAV) 벡터에 도입 가능한4.7 kb이하의 마이크로지스트로핀 유전자(CS1, AX11, M3) 를 제작했다.

　한편 , 유트로핀은 지스트로핀과 구조가 유사하고 있어 , 지스트로핀의 대체품으로서 약물 요법으로 이용할 수가 있다고 기대되고 있다.

　
여기까지 짧게 한 마이크로지스트로핀이 실제로 치료 효과를 가질지 어떨지 확인할 필요가 있습니다. 그런데 ,DMD의 모델이 되는 마우스에 마이크로지스트로핀을 도입해 강제 발현시켰습니다 (이와 같이 , 유전자를 강제 발현시킨 마우스를 트랜스제닉(transgenic) 마우스라고 부르고 있습니다 ).

　이 모델은 , 전신의 근육에 빠짐없이 대량으로 바이러스 벡터로 유전자 도입한 것과 같은 효과를 나타낼 것입니다. 그러자(면) , 마이크로지스트로핀을 강제 발현시킨 마우스에서는 , 근육의 변성상 , 근육의 힘 , 및 근육의 붕괴의 지표인CK (쿠레아틴키나제)의 치가 , 정상의 마우스와 차이를 볼 수 없게 될 때까지 개선하고 있었습니다 (그림3).

그림3. 마이크로지스트로핀 유전자에 의한mdx마우스의 증상 개선
　마이크로지스트로핀 유전자(CS1, AX11, M3) (그림 1참조) 에 임해서 , 트랜스제닉(transgenic) 마우스를 작성했다.

　더욱 , 동트랜스제닉(transgenic) 마우스를 지스트로핀을 가지지 않는mdx마우스와 교배해 , 전체 길이형 지스트로핀이 완전히 없는 상태로 , 근 디스트로피의 표현형을 검토했다 (상단).

　3.7kb의M3,4.4kb의AX11에서는 근 디스트로피 증상의 개선 효과는 보여지지 않았지만 ,4.9kb의CS1에서는 매우 분명하게 개선하고 있었다.
근 디스트로피에 의한 변성에 의해 발생하는 중심핵 섬유의 빈도를 지표로 하는 검토(하단) 에서도 ,CS1를 도입한 트랜스제닉(transgenic) 마우스에서는 ,mdx마우스에 비해 의미가 있게 감소해 , 컨트롤의 정상 마우스(C57BL/10) 와는 차이가 없었다.

　이것은 , 만약 벡터를 효율적으로 전신의 근육에 유전자를 도입할 수 있으면 , 도입된 세포는 정상적으로 가까운 기능을 가질 가능성을 나타낸 것입니다. 게다가 지스트로핀 단백의 중요한 기능인 , 다른 여러가지 결합 단백과의 결합도 확인할 수 있었습니다.　지금 , 우리는 작성한 마이크로지스트로핀을AAV벡터에 짜넣어 , 근육내 주사로 어느 정도의 증상의 개선을 볼 수 있는지를 관찰하고 있습니다.

목차에 돌아온다

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2.　재생 이식 치료

　바이러스 벡터를 이용한 방법을 실용화하기 위해서는 , 몇개인가 문제점이 남아 있습니다. 예를 들면 , 전신의 근육(그 중에는 횡격막이나 심장의 근육이라고 하는 , 직접 주사하기 어려운 곳도 포함되어 있습니다 ) 에 어떻게 벡터를 널리 퍼지게 하든가 , 혹은 바이러스 벡터가 이물로서 체내의 면역계에 제거되는 것을 어떻게 막는지 , 등의 점입니다. 수혈이나 골수 이식과 같이 , 정상적인 근육의 세포 그 자체를 이식하는 방법은 없는 것으로 짊어질까.　

　최근 ,DMD과 같은 난치병의 치료에 , 미숙한 상태의 세포를 이식하는 연구가 주목받고 있습니다. 미숙한 세포는 , 면역 반응을 일으키기 어렵고 , 그리고 링겔 하는 것만으로 혈류에 올라 전신에 가까스로 도착할 수가 있기 때문입니다. 특히 ,side population로 불리는 세포(SP cell) 가 유효하지 않을까 기대되고 있습니다. SP cell(은)는 골수 , 근육 , 뇌등 여러가지 장기로부터 채취할 수 있는 특수한 세포의 집단에서 , 여러가지 조직·세포에 분화해 가는 능력이 있는 세포(간 세포) 가 많이 포함되어 있습니다.

　이SP cell를 골수 이식의 요령으로 이식하면(자) 골격근에도 분화하는 것이 보고되고 있습니다. 지스트로핀을 가지지 않는 마우스에 정상 마우스의 근육이나 골수 유래의 것SP cell을 정맥내에 투여했는데 , 골격근내의 소량의 세포가 지스트로핀을 발현했던 것이 발표되고 있습니다. 같은 방법이 인간이라도 응용할 수 있을지도 모릅니다 . SP cell(은)는 여러가지 성질을 가진 다른 세포의 집단이라고 생각되고 있습니다만 , 자세한 성격에 대해서는 아직 잘 알고 없는 점도 많기 때문에 , 현재 연구가 진행되고 있는 한중간입니다 (그림4).

그림4.골격근 세포의 증식과 분화

　근육이 재생할 때는 , 간엽계간 세포가 바탕으로 된다. 이 세포는 , 골격근 이외에도 , 심근 , 혈액계 세포 , 뼈·연골 등 , 여러가지 조직·세포에 분화할 수가 있다.

　간엽계간 세포 중 일부가 골격근 계보의 간 세포 , 한층 더 근아 세포(myoblast) 로 분화한 후 , 융합해 근관(myotube)이 되어 , 줄기 섬유(myofiber) 로 성숙한다.

　근아 세포의 일부는 줄기 위성 세포(satellite cell) 로서 활발하지 않은 상태로 정지하고 있다. 골격근이 장해를 받으면(자) 줄기 위성 세포는 증식 해 , 줄기 위성 세포끼리 , 또는 벌써 있는 줄기 섬유와 융합해 골격근을 재생시킨다.

　이 때 , 일부의 세포는 다시 줄기 위성 세포가 된다. 최근 , 뇌나 골수로부터 분리되었다side population cell(SP cell) 가 배양 세포계로 골격근에 분화했다고 연달아 보고되고 있지만 , 그 골격근 발생 또는 줄기 재생에 있어서의 자리 매김을 하고나 역할에는 정견이 없다.

　우리는 , 이SP cell의 정확한 정체를 밝혀내는 것과 동시에 , 어떻게 하면(자)SP cell가 효율적으로 줄기 세포가 되어 갈까 연구를 진행시키고 있는 곳(중)입니다.

목차에 돌아오는

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3. 약물 치료

　우리는짣MD에 결손하고 있는 지스트로핀과 잘 닮은 단백질인 유트로핀을 사용한 약물 요법의 가능성에 주목해 연구를 진행시키고 있습니다 (그림1). 유트로핀은 지스트로핀에 구조가 비슷한 세포 골격 단백질입니다만 , 정상적인 것은 성숙한 근육에는 보지 못하고 , 유 젊은 줄기나 재생한 근육에게만 일과성에 발현할 뿐입니다. 여러가지 실험의 결과로부터 , 유트로핀은 지스트로핀의 기능을 어느 정도 대상할 수 있는 것을 알고 있습니다만 , 어느 정도의 기간형개로 없어져 버리지만 같습니다.

　만약DMD의 환자분의 근육에 유트로핀이 계속 존재하면(자) , 증상을 경감 할 수 있는 것은 아닐까요. 우리는 , 근육이 감염등에 의해 강한 염증을 일으키면(자) 유트로핀이 증가하는 것을 찾아내고 있습니다. 지금부터 유트로핀의 발현과 관계되는 구조를 해명해 , 약물로서의 유트로핀의 치료에의 실용화를 생각하고 있습니다. 유트로핀 외에도 ,DMD에 대해서 약으로서 사용할 수 있을 가능성이 있는 물질이 고안 되고 있습니다.

　어떤 종류의 항생 물질(아미노 배당체) 을 대량으로mdx마우스에 투여하면(자) , 마우스의 증상이 좋아졌습니다. m dx마우스는 지스트로핀 유전자 중 1개소가 점 변이에 의해 그 이상 단백에의 번역이 일어나지 않는 「정지 신호」(정지 코돈이라고 합니다 )이 되어 있기 (위해)때문에 , 지스트로핀은 도중 까지 만들어져도 완전한 길이가 되지 않고 불안정해서 , 곧바로 망가져 버립니다. 아미노 배당체를 대량으로 투여하면(자) , 이 정지 신호를 읽어 날려 버리는 기능이 있으므로 , 전체 길이형의 지스트로핀이 합성된다고 하는 도리입니다.

　이 방법을 이용해 조속히 여러가지 정지 코돈을 가지는DMD/ BMD환자분에게 치험을 했습니다. 유감스럽지만 , 투여 전후로 지스트로핀의 발현에는 변화가 없었습니다. 이것은 부작용을 고려해 소량 밖에 사용하지 않았기 때문에일지도 모르지 않고 , 부작용의 적은 별도인 약제를 사용하거나 약을 증량 하거나 하는 시도가 되고 있습니다. 그 외에 , 핵안에 잘 닮은 배열의 유전자를 넣으면(자) , 원래의 유전자와 바뀐다고 하는 현상(상동성 새로 짜넣고 ) 이 발생하는 것을 이용해 , 변이 부분을 수복하는 방법이 있습니다. 이 방식에서는 지금까지는 발현량이 지극히 적은 것이 문제였지만 , 실제로 지스트로핀의 발현을 증명하고 있는 그룹도 있습니다.

목차에 돌아오는

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끝에

　DMD의 치료 연구의 현상을 이야기했습니다. 여러가지 대처가 이루어지고 있는 것 , 그리고 , 어느 방법도 실현은 반드시 용이하지 않은 것이 이해라고 생각합니다. 곤란함의 하나에 , 지금까지 적절한 모델 동물이 존재하지 않았던 것을 들 수 있습니다. 마우스의 실험으로 잘된 것을 사람에게 응용해도 , 실패인 일이 많이 있었습니다.

　지스트로핀을 결손한 모델 동물로서는 ,mdx마우스가 있어 , 병의 용태 연구에도 빈용 되어 왔습니다만 ,DMD과 달리 소형인 위에 , 비교적 경증으로 진행성도 눈에 띄지 않고 ,DMD환자분으로 큰 문제가 되는 심근 장해도 확실하지 않습니다. 그런데 우리는 모델 동물로서 지스트로핀이 결손하고 있는 근 디스트로피개에 주목해 왔습니다. 근 디스트로피개는 진행성으로 심근 장해를 포함한 중증의 임상형을 나타내 , 사람의 증상과 잘 닮았습니다.

　작년 국립 정신·신경 센터내에 근 디스트로피개 콜로니가 설립되었습니다. 목하 , 우리는 이하의 2점에 대해 연구하고 있습니다. 하나는 , 지금까지 이야기해 온 것 같은 분자 치료가 , 실제로 근 디스트로피개로 유효한지 어떤지입니다. 소형의 동물인 마우스로 효과를 볼 수 있어도 , 개나 사람과 같이 큰 동물로도와 같이 효과가 없으면 의미가 없습니다. 현재 , 조금 전 말한AAV벡터를 이용해 , 유전자 도입을 실시하고 있습니다. 그리고 ,SP cell를 이용한 세포 이식 치료의 계획도 세우고 있습니다.

　하나 더는 ,DMD의 심근 장해의 연구입니다. 근년 , 인공 호흡기등의 기구의 사용에 의해 ,DMD의 환자분의 수명은 늘어나 왔습니다. 거기에 따라 , 심근 장해에 의해 죽으시는 환자분의 수가 많아지고 있습니다. 심근은 골격근과 같이 지스트로핀을 가지고 있습니다만 , 골격근과 같이 줄기 세포끼리가 서로 융합하는 것이 없는 등 , 몇개인가 특별한 성질이 있습니다. 그리고 ,DMD나BMD먼 글자 지스트로핀의 비정상이어 , 심근에만 장해가 나오는 환자분의 존재도 알려져 있습니다. 지스트로핀의 이상이 어째서 심근 장해를 일으키는지 밝혀져 , 한층 더 그 치료법이 해명되면 , 많은DMD환자분의 생명을 구할 수가 있을 것입니다.

　치료를 실현시키기 (위해)때문에 , 우리를 시작으로 해 온 세상의 모든 연구 그룹이 총력을 주어 연구하고 있습니다. 지금까지 설명한 것처럼 , 실현에는 여러가지 문제점이 있는 것 , 그 문제점에 간신히 해결의 손이 펴져 왔던 것(적)이 이해해 주실 수 있었는지라고 생각합니다. 분자생물학의 진보는 , 지금까지의 상식을 뒤집은 치료법을 짜낼 가능성이 있습니다. 그러나 항상 변함없는 것은 , 하루라도 빨리 , 질환에 괴로워하는 환자분을 어떻게든 구하고 싶다고 하는 우리의 소원입니다.

목차에 돌아온다

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