Wright-Giemsa Stain

[택시아찌따~블]

 1. 검사종목 : wright-giemsa stain

 2. 검체준비

1) 대부분 정맥혈과 모세관 혈액을 사용한다.

2) 모세관 혈액 : 항응고제를 사용하지 않은 혈액으로 주로 신생아들에게 사용한다.

3) EDTA blood

: 응고방지, 혈소판의 응집을 막아주는데 좋으며 비교적 혈구 세포의 형태 변화를 주지 않는다.

4) 주의 : 혈액이 들어 있는 시험관에 응고가 형성되었나를 점검하고 항응고제에 의한 부산물을 방지하기 위하여 1시간   이내에 도말하여야 한다.

5) 결과가 확인된 도말표본의 경우 2주일 동안 보관한 뒤 버린다.

6) Unusual slides는 file box에 보관한다.

⊙ 참조 : 백혈구 수동(manual) 감별계산 기준

1) 혈액검사 의뢰시 백혈구 감별계산에 있어 수동으로 검사할 것을 요구할 경우

-의뢰지에 manual이라고 기재한다.

2) 백혈구의 형태학적이상 flag가운데 Blast, IG, NF P 가 나오는 경우

Left shift, Atyp.L, 에 flag(* 또는 ++) 가 나오는 경우

3) LUC 가 6% 이상인 경우

4) Platelet 수치가 50,000이하인 경우

5) 누적검사시 platelet수치가 급격히 떨어진 경우

6) 담당자가 세포분포도 양상으로 도말확인이 필요하다고 여겨지는 경우

7) WBC 가 15.000 이상인 경우

8) 총 WBC가 많은 경우임에도 Lymphocyte수치가 높은경우(normal참조)

9) 성인임에도 Lymphocyte수치가 높은 경우( >75% )

10) Basophil 수치가 5% 이상인 경우

11) monocyte, eosinophil 수치가 비정상적으로 높은경우

histogram 관찰시 확연히 드러나는 이상검체는 반드시 현미경 관찰하고 장비 이상으로 나타나 는 분포이상도 감지 할 수 있어야 한다.

12) MPXI < -17 인 경우

 

3. 검체 부적합성 판정기준

1) 검체는 24 시간 이내의 것이어야 하며 응고된 검체는 부적당하다.

2) 염색된 슬라이드가 청색이거나 혹은 적색 또는 너무 두껍거나 얇은 경우 부적당하다.

 

4. 시약

1) Wright-Giemsa Solution

Powdered commercial Wright stain ....................... 61.85 g

Powdered commercial Giemsa stain ....................... 6.87 g

Glycerin ............................................... 620 ml

Absolute methyl alcohol .............................. 20.000 ml

2) Wright-Giemsa stain buffer solution

Potassium phosphate monobasic (KH2PO4, M.W.=136.09)..... 5.418 g

Sodium phosphate dibasic 12-hydrate .................... 4.515 g

(Na2 HPO4, 12H2O, M.W.= 358.16)

D.W. .............................................. to 12.000 ml

3) Wright-Giemsa & buffer 혼합액

Wright-Giemsa sol. - 25ml

buffer sol. - 225ml

4) Wright-Giemsa stain 용액 만드는 방법:

  1. 정확히 무게를 측정.

  2. Powder를 약절구에 넣고 glycerin을 반정도 넣고 갈아서

  3. Methyl alcohol를 소량 부어서 잘 녹이면서 저장 탱크에 담는다.

  4. 만든후 잘 혼합하여 냉암소에 3-6개월 성숙시킨 다음에 사용한다.

 

5. stain 방법 ( Wright-Giemsa stain procedure)

1. Peripheral blood smear를 99% methyl alcohol에 5분간 고정.

2. Wright-Giemsa solution에 15분간 염색한다.

3. Buffer solution(Wright-Giemsa sol: 25ml + Phosphate buffer 225ml)에

5분간 염색후 tap water로 행군다.

4. Bone marrow slide는 고정: 10분, wright-giemsa sol에 20분, buffer에

8분 정도로 염색한다.

 

6. 정도관리

1) 5C를 이용한 백혈구 감별계산 정도관리를하여 file한다.

2) Randomized duplicate : 기계상에 정상으로 확인된 검체를 1 개만 찾아 도말표본을 제작하여 현미경으로 감별 계산하여 유의한 차이를 보이면 계장에게 알려 해결할 수 있게 한다.

3) 국내·외 외부 정도관리(CAP & 진단혈액학 국내 정도관리) program을 이용하여 개인적인 판독 평가 기준을 통일하고 판단기준이 다르면 통일시키는 교육을 실시하며 기록으로 남긴다.

4) 필요할 때마다 교육을 실시하여 자료를 보관한다.

5) 기계에서 백혈구 감별계산이 정상으로 확인된 결과 중 한 case를 선정하여 그 환자검체로의

 

7. 장비

1) Microscope 2) Glass slide : 1 × 3인치

3) Stain jar & rack 4) Slide warmer

5) Differential counter

 

8. 검사방법

1) 도말표본 제작법

(1) Criteria for the PB smear

① Hb(g/dl) < 7.0

② MCV(fl) < 70 or > 105

③ WBC(/ul) < 3,000 or > 15.000

④ Lymphocyte > 50%, monocyte > 20%, eosinophil > 20%, Basophil > 3%

⑤ "R" flag와 +++ 가 보이는 경우

⑥ Histogram이 비 정상일 때(giant platelet, peudomacro/microcytosis)

⑦ Diff count가 ---- 로 안나오는 경우

⑧ 다음과 같은 suspect flagging이 있는 경우

(Blasts, Imm Grans/bands 2, varient lymphs, review slide, nRBCs, RBC agglutination, platelet clumps)

(2) 검체를 잘 섞은 후 시험관 뚜껑으로 혈액의 적당한 양 (1 drop)을 슬라이드 한구석에 떨어 뜨려 도말이 슬라이드의 ⅔정도 차지하도록 25°각도를 유지하면서 도말하여 wedge가 형성되도록 하고 가능한 한 빨리 건조시킨다.

(3) 건조된후 연필로 도말의 두꺼운 부분에 이름과 접수번호, 날짜를 기록한다.

(4) 건조시킨 혈액도말을 염색 rack에 꽂아 methanol에 slide가 충분히 잠기게하여 도말을 5분간 고정한다.

(5) 5분후 methanol jar에서 rack을 꺼내 Wright - Giemsa sol.이 들어있는 염색 jar로 옮겨15 분간 염색한다.

(6) Wright - Giemsa -buffer 혼합용액에 5분 염색 후 흐르는 물로 씻은 다음 건조시켜 현미경으 로 관찰한다.

(7) 기기에서 나온 검사 결과지와 슬라이드를 맞추어 준비한다.

 

2) 도말표본 판독법

(1) 슬라이드를 현미경에 놓고 광량을 조절한 후 저배율로 초점을 맞추고 도말 상태를 점검한다.

(2) 저배율로 관찰할때 도말표본이 너무 얇게 만들어져 백혈구가 끝쪽으로 밀려나가 있으면 핵이 큰 blast 혹은 monocyte 등은 계산에서 빠질수 있으므로 다시 제작 한다.

(3) 도말표본상에서 보이는 세포수와 worksheet에서 보이는 세포수를 비교하여 맞는지를 확인 하여주고 worksheet의 histogram이 정확한지를 확인한다. 이때 백혈구 감별계산중 basophilia 가 3% 이상이면 다시 계산하여 보고 한다.

(4) 저배율 관찰시 혈소판의 응집이 보이는지를 보고 만일 있으면 oil lens로 돌려 확인한다.

(5) 도말의 끝쪽을 피해 적혈구가 떨어져 있는 것이 50%, 붙어 있는 것이 50%인 이상구역 (ideal zone)을 선택한다. 혈소판 응집, 환영 세포(ghost cell), 혈구, microorganism등의 전반 적인 사항을 관찰 한다.

(6) 백혈구 감별계산은 유침 오일을 1 방울 떨어뜨려 유침 렌즈(×100)로 1∼2 시야 정도 띄우며 100개의 백혈구를 세는데 백혈구 감별계산 하는 동안 유핵 적혈구가 나오면 따로 계산하여 총 백혈구 수를 교정한다.

(7) 도말 표본의 형태 관찰은 적혈구의 형태를 관찰하여 크기, 모양, 염색성 등에 유의한다.

진단성을 나타내는 겸상 적혈구, 구형 표적세포, burr cell, 현저한 연전현상, 난원 적혈구, Howell-Jolly body, Cabot ring 봉입체, basophilic stippling, 말라리아 기생충등이 있는지를 확인 해야하며 혈소판의 수를 추정하고 거대 혈소판이 보이면 표시하여준다.

(8) Worksheet에 찍힌 백혈구 감별계산 결과와 도말표본에서 보이는 결과의 차이가 크면 도말 표본이나 worksheet가 바뀌었는지 확인한다.

(9) 판독결과 보고시 RBC 대한 morphology 결과도 보고한다.

(10) 판독이 끝나면 host computer에 입력시키고 확인한다.

(11) Unusual slides는 계장과 의국에서 재검토하며 또한 판독이 끝난 모든 도말표본은 최소 2주간 보관한다.

3) Thin & thick smear for malaria

* Thin smear *

(1) Malaria smear 의뢰가 오면 EDTA blood 1 bottle이 필요하다.

(2) 검체를 잘 혼합하여 pipette으로 whole blood 50ul를 취하여 깨끗한 slide의 1/5 지점에 놓는다.

(3) 밀대의 각도를 45℃정도로 세워 두껍게 blood film을 2-3장 정도 만든다. 반드시 air dry한다.

(4) Wright- Giemsa stain 후에 1000× oil lens에서 300 field를 관찰하고 malaria가 보이면 주치 의에게 즉시 알리고 결과는 의국에서 확인시킨다.

 

* Thick smear *

(1) EDTA blood를 이용한다.

(2) 50ul 정도의 blood를 slide 중간에 놓고 wood stick를 이용하여 지름이 1cm정도되도록 동그 랗게 smear 한다.

(3) Wright-Giemsa로 염색하여 oil lens에서 300 field 관찰한 후 즉시 보고한다.

 

9. 결과계산 및 보고방법

1) 백혈구 감별계산은 도말표본을 제작하여 확인한 결과와 기계적인 결과가 동일하면 굳이 기계적인 수치를 수정할 필요없이 그대로 보고한다.

2) 감별이 곤란한 세포가 있어도 백분률에서 제외되어서는 안된다. 또한 유핵 적혈구가 10% 이 상일 경우 백혈구 전체수를 교정해주고 수정된 이유를 기록하여 준다.

전체 백혈구수

※ 교정 백혈구수 = -------------------- × 100

100 + 유핵 적혈구

3) 100개의 백혈구를 세는 동안 blast, promyelocyte, myelocyte, metamyelocyte, band neutrophil, neutrophil, lymphocyte, monocyte, eosinophil, basophil 등을 구분하여 보고하는데 이때 림프구 감별시는 atypical, activatedlymphocyte, abnormallymphocyte등 3가지로 구분하는데 plasmacytoid, abnormal lymphocyte는 lymphocyte로 계산하고 소견참조에 이 사항을 표시한다.

4) CBC결과가 delta check에 걸린 결과는 슬라이드를 찾아서 다시한번 확인한 후 보고한다.

5) 혈소판 결과가 100,000/ul 이하고 도말표본에서 심한 혈소판 응집을 보이면 혈소판 수치를 지우고 병동에 연락하여 재검을 하거나 아니면 sod. citrate 튜브에 채혈하도록 하고 기록을 남긴다.

6) 염색한 도말표본 관찰시 미세한 혈소판 응집이 보이면 소견참조로 들어가서 약간의 혈소판 응집 이 있슴을 기록하여 보고한다.

7) 현미경적 관찰결과 혈소판응집이 중간이상(cluster)으로 보이고 기계적인 수치가 100,000/ul 이하면 보고하지 말아야 하며 결과를 지우고 소견참조로 넣어 citrate 튜브에 채혈하여 재검 하도록 comment한다.

8) 혈소판의 기계적인 계산과 도말표본 관찰 결과가 일치하지 않고 giant platelet가 관찰되는 경 우는 수기법으로 계산하여 보고한다.

9) 판독중에 판단이 어려운 세포가 있거나 신환에게서 blast가 발견되면 계장이나 의국에 알린다.

 

10. 참고치

1) Band neutrphil : 2 ∼ 6%

2) Segmented neutrophil : 50 ∼ 75%

3) Lymphocyte : 20 ∼ 44%

4) Monocyte : 2 ∼ 9%

5) Eosiniphil : 1 ∼ 5%

6) Basophil : 0 ∼ 2%

11. 검사결과의 임상적 의의

1) WBC differential count

 

Neutrophilia	감염, 독성, 자극, 괴사, 출혈, 용혈, 혈액학적 관찰, 고형암
Neutropenia	myeloid hypoplasia, infective granulocytosis, decreased survival, pseudoneutropenia.
Eosinophilia	allergy, 피부질환, 기생충 감염.
Basophilia	allergy, CML, PV, acute basophilic leukemia, myeloid metaplasia.
Monocytosis	감염후 회복기, subacute bacterial endocarditis, 혈액 질환 및 일부 악성종양.

2) 형태관찰

(1) WBC (백혈구)

① 다분엽 호중구(거대적 아구성 빈혈 의심시) : 호중구의 분엽이 6개 이상 분절된 경우, 악성 빈혈 또는 선천성 질환시(엽산, 비타민 B12의 결핍시)

② 독성과립(toxic granulation) : 과립이 진해지고 또한 커지며 세포질 내에도 소공포가 있다. 심한 감염증 (폐렴, 폐혈증)

③ Dohle body : 세포질 내에 호염성의 직경 2um 정도의 청색으로 염색되는 소체이다.

심한 감염증

④ 소공포(vacuolation) : 단구나 형질세포에는 정상 세포에도 소공포가 있을 수도 있다.

이 외의 세포에 소공포가 있으면 비정상이다. 보통 진행성 근이양증일때 볼 수 있다.

⑤ Auer body : 세포질 내에 적색 자색 소체며 주로 급성 백혈병일때 골수구 계통을 진단할 수 있는 가치가 있다.

⑥ 비 정형 림프구 : 전염성 단핵구성때 나타나는 비정상 림프구로써 Downey cell - I, II, III형으로 구분

⑦ Alder 이상 혹은 Reilly body : 호중구 세포질내에 굵고 진한, azurophilic granule이 있는 것, Hurler's syndrome, genetic mucopolysaccharidosis

⑧ Pelger-Huet 이상 : 유전적으로나 후천성으로 neutrophil의 핵이 hypolobation으로 나온다.

⑨ Intracytoplasmic organisms : pathogenic bacteria, fungi(histoplasmosis, candidasis)

(2) RBC 적혈구

① Microcytosis : 철결핍성 빈혈

② Macrocytosis : B₁₂ or folate 결핍, 간질환, MDS

③ Anisocytosis : 빈혈의 감별진단에 중요

④ Poikilocytosis : 심한 용혈성 빈혈, 만성실혈성 빈혈, 악성빈혈 ,수혈

⑤ Spherocytosis : 선천성 구상적혈구증

⑥ Target cell : thalassemia, hemoglobinopathies, chronic liver disease

status post splenectomy

⑦ Elliptocytosis : 철 결핍성 빈혈, 선천성 질환

⑧ Burr cell : 요독증, 위암, 위 궤양

⑨ Tear-drop cell : myeloproliferative disorders

⑩ 봉입체 이상 구조물

* Basophilic stippling (호염기성 반점)

: 납, 아연, 수은, 비스무스 중독, 중금속중독, 악성빈혈, 백혈병등.

* Cabot ring : 악성 빈혈

* Heinz body : 용혈성 빈혈, phenylhydrazine, nitrobenzol, aniline 중독

* Howell-Jolly body : status post splenectomy, megaloblastic anemia 등

* Malaria, babesiosis

 

12. 즉시 보고해야 하는 검사 결과의 한계

현미경 관찰시 blast cell이 나오면 신환(new patient)인 경우와 혈소판 수치가 5,000/ul 이하인 경우는 의국에 알린다.

 

13. 검사결과에 영향을 줄 수 있는 사항( pre-analytical error source )

1) 도말이 너무 두껍거나 불충분한 수세, 염색이 길어졌거나 완충 용액이 지나치게 알칼리성일 경우는 염색상이 청색을 띄게된다.

2) 완충용액이 지나치게 산성일 경우는 붉은색을 띄게된다.

3) 항응고제를 사용하지 않은 도말이 가장 좋다. 항응고제를 사용할 시는 채혈 후 적어도 1시간 이내에 도말해야하고 heparinized blood를 사용할 경우는 염색상이 좋지 않다.

4) 혈액 도말 표본은 세포가 균일하게 분포되어 있도록 만들어져야 정확한 백분율을 구할수 있다.

5) 백혈구 수가 적어서 백분율을 낼 수 없을 때에는 50개 혹은 10개만 세어서 백분률로 보고하거나 백혈구 감별계산이 불가능하다고 기록한다.

 

14. 참고문헌

1) John Bernard Henry : Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods, 19th ed., Philadelphia, W.B. Saunders Co., 1996

2) Simons A : Hematology, A Combined Theoretical and Technical Approach, 2nd ed., Butterworth-Beinemann, Boston, Oxford, 1997, pp. 267-272