<pre>Probiotic을 이용한 대하새우양식장 환경개선 및
생산성 향상 기술개발
Environmentalimprovementandproductivity
elevationbyusing probioticsinshrimpculture
ponds
2005.12.
순 천 향 대 학 교
국립수산과학원 서해수산연구소
해 양수산부
보고서를 “Probiotic을 이용한 대하새우양식장 환경개선 및 생산성 향상 기술개발”과제의 최종보고서로 제출합니다.
2005년 12 월
주관연구기관명 :순천향대학교
총괄연구책임자 :마 채 우
세부연구책임자 :오 계 헌
연 구 원 :신현웅,방인철,오철웅,
김정년,최충호,임성도,
정인주,김종춘,정윤환,
손대선,김광섭,천재우,
이성희,노경미윤덕현
협동연구기관명 :국립수산과학원 서해수산연구소
협동연구책임자 :장 인 권
연 구 원 :김찬옥,임현정,전제천,
이진호,한현섭,이실한,
김수경,서형철
Probiotic을 이용한 대하새우양식장 환경개선 및 생산성 향상 기술개발
Ⅱ.연구개발의 목적
1.새우양식장 환경과 생태학적 요인 분석
2.새우양식 생산성 향상을 위한 유익세균 검색
3.새우양식장 수질환경 정화를 위한 유익세균 제재 개발
4.기존 유익세균 제재(probiotant)의 수질개선 효과 연구
5.개발된 Probiotant의 질병억제 및 생산성 향상
Ⅲ.연구개발 내용
1.새우양식장 환경 및 생물생태학적 요인
2.새우양식장에 서식하는 곤쟁이의 개체군 역학
3.새우양식장 유용 및 유해세균 검색
4.미생물에 의한 새우 양식장 환경정화:미생물학적 질소 및 인 제거
5.새우 양식장에서 양식사료에 의한 오염환경의 미생물학적 제거
6.새우 양식장에서 분리된 세균의 유용성 탐색
7.새우 양식장 환경 정화를 위한 제제 개발
8.수질변화에 미치는 probiotics의 효과 시험
9.새우양식장의 양식생태 조사
10.Probiotics를 이용한 새우양식장 수질개선 및 질병억제 효과시험
Ⅳ.연구개발결과
Ⅳ.연구개발결과
1.대하새우장에서 새우의 성장에 영향을 미치는 용존산소,수온,pH,염도,NH4-N,NO2-N,
NO3-N,클로로필 a를 포함하는 몇 가지 환경요인들을 조사하였다.
2.조사기간 동안 수온의 범위는 23.8～33.1℃,염분은 17.5～31.2ppt,용존산소는 5.08～8.22
ppm의 범위를 나타내었다.양식장 수질내에 용존되어 있는 NH4-N,NO2-N,그리고 NO3-N의
농도는 각각 0.024～0.034,0.003～0.020,0.004～0.009 mg/L였다.클로로필 a는 0.002～0.118
ug/m3 범위에 있었다.양식장에서 채취한 수질에서 다른 세균들의 분포를 알아보기 위하여
marine agar plates에서 분리 계수하였다. 총세균수는 대략 6.5 × 104까지 증가하였다.
BIOLOG 시험들 통하여 13가지의 세균들을 분리 동정하였다.동물플랑크톤의 종조성 및 개체밀
도 조사에서는 대하를 양식하는 호지에서 11종으로 나타났으며,출현개체밀도를 보면,평균
59,399ind./m3로 나타났다.
-3-
3..대하새우 양식장에 서식하는 곤쟁이,Neomysisjaponica의 개체군 역학과 성 성숙에 관
한 전반적인 생물학적 정보를 규명하였으며,조사를 위한 표본의 채집은 충남 태안군 남면 당
암리에 소재한 순천향대학교 해양수산연구소의 대하새우 양식장에서 2002년 10월부터 2003년
9월까지 12개월 동안 월 1회씩 채집하였다.
4.곤쟁이의 개체군의 특징을 알기 위해 성비를 분석하였는데 암컷이 수컷에 비해 57.4%로
높은 수치를 나타내었다.또한 평균 갑각장 (±표준편차)은 암컷이 2.31(±0.52)mm이며,수컷
이 2.42(±0.48)mm로 수컷개체가 암컷개체보다 평균 갑각장이 더 큰 것으로 나타났다.
5.암컷에 있어서 갑각장과 포란수의 관계는 갑각장이 증가함에 따라 포란수가 증가하였다.
전체 암컷 중에서 포란한 암컷을 성숙한 암컷으로 판단하여 추정된 암컷 개체의 50%가 성숙
에 이르는 군성숙 체장은 4.48mm로 나타났다.
6.ELEFAN 프로그램에서 추정된 vonBertalanffy 성장 매개변수를 바탕으로 계절적인 성
장변동요인을 고려한 성장식을 추정하였을 때 동일한 연령에서 수컷보다 암컷의 성장률이 더
빠른 것으로 나타났다.
7.어획물 곡선법에 의해 추정된 순간전사망계수는 3.46yr-1로 나타났다.ELEFAN 프로그
램에 의해 추정된 가입유형은 두개의 정규분포 곡선으로 나타났고,추정 된 가입 갑각장은
4.46mm로 나타났다.
8.상대성장은 갑각장과 전장을 자연로그 변환 후 갑각장 (CL)에 대한 전장 (TL)의 회귀분
석 결과 상관계수는 비록 낮게 나타났지만 유의한 상관관계를 보여주었다.이러한 결과는 암컷
에 비해 수컷의 갑각장과 전장이 더 큰 것으로 나타났다.
9.새우양식장내 환경개선과 병원성 세균에 대한 항균작용을 갖는 probiotics미생물에 대한
연구를 실시하였다.
10.본 연구의 첫 번째 부분에서는 수질오염원인 질소와 인의 미생물학적 제거에 대한 연구
를 수행하였다.새우양식장에서 채취한 물시료로부터 질소와 인을 제거할 수 있는 농화 배양을
획득하였다.농화 배양으로부터 질소와 인 (N/P)이 포함된 고체 평판 배지에서 4개의 균주를
분리하였고,이들 분리세균 가운데 N/P 제거가 탁월한 두개 균주인 CK-10과 CK-13을 이용하
여 호기적 조건에서 N/P제거 실험을 실시하였다.
11.분리 균주는 현미경을 통하여 그람 양성이고,간균의 형태임이 관찰되었다.BIOLOG
system을 이용한 생리학적 분석을 통하여 이들 세균은 Bacillus subtilis CK-10과 Bacillus
thurigiensisCK-13으로 각각 동정 및 명명되었다.
12.질소 (NH4
+,NO2
-,NO3
-)와 인 (PO4
3-)의 제거는 호기적 조건하에서 250㎖ 삼각 플라스
크에서 N과 P를 포함하는 배지내에서 CK-10과 CK-13을 단일배양과 혼합배양을 병행하여 각
각 조사하였다.단일배양에서 CK-10과 CK-13은 400μM NH4
+를 24시간과 60시간 이내에 완
전히 제거하였고,CK-10과 CK-13을 혼합한 혼합배양에서는 400μM NH4
+를 12시간내에 완전
히 제거하였다.CK-13과 혼배배양에서는 400μM NO2
-를 배양 12시간이내에 완전히 제거하였
으나,CK-10은 36시간만에 제거하였다.CK-10은 400μM NO3
-에서 생장하였으나,배양기간동
안 NO3
-을 완전히 제거하지 못하였고,CK-13과 혼합배양에서는 60시간 36시간이내에 각각 완
전히 제거하였다.단일배양과 혼합배양에 의한 125～500 μM PO4
3- 제거실험을 실시한 결과,
CK-10과 혼합배양에서는 PO4
3-를 36시간이내에 완전히 제거하였고,CK-13은 배양 60시간내에
완전히 제거하였다.
-4-
13.질소와 인을 모두 포함하는 배지내에서 혼합배양에 의한 질소와 인 동시제거 실험을 실
시하였다.그 결과,400 μM NH4
+와 NO2
-는 12시간이내에 제거되었고,NO3
-는 36시간이내에
각각 제거되었으며,500μM PO4
3-도 36시간이내에 제거되었다.이 결과로 배지에 포함된 질소
와 인 제거는 혼합배양에 의한 가속화되는 것이 증명되었다.
14.양식사료에 포함된 당은 HPAEC-PAD 시스템을 이용해 분석되었다.그 결과,사료에
포함된 당은 glucose> galactose> galatosamine> mannose > fucose순으로 확인되었다.
0.2% 사료로부터 N/P는 약간 용출되는 것이 측정되었다.CK-10과 CK-13을 사료에 접종한 후
일정량의 N/P가 용출되었으며 이들 세균에 의하여 제거되는 것이 관찰되었다.혼합배양에서는
단일배양에서 보다 용출된 N/P를 효과적으로 제거하였으며,용출된 모든 N/P는 배양 84시간
이내에 완전히 제거되었다.그 결과 혼합배양에 의한 N과 P 제거는 시너지 효과 (synergic
effect)를 나타내는 것으로 확인되었으며,혼합된 Bacillussp.CK-10과 Bacillussp.CK-13은
단일 배양에 의한 것보다 질소와 인을 효과적으로 제거하는 것이 관찰되었다.
15.본 연구의 두 번째 부분에서는 여러 가지 어류 질병원인 세균에 대한 해양환경으로부터
분리된 세균에 의한 항균활성 측정과 항균물질의 특성을 조사하였다.JK-8과 JK-11균은 양식
장에서 채취한 물시료으로부터 분리되었고,MRS 배지에서 생장되었다.이들 균주는 현미경 관
찰을 통하여 그람 양성이며,간균형태의 세균임이 관찰되었고 BIOLOG 시스템을 이용한 생리
학적 분석을 통해 동정되었다.GP2 Microplate의 당 이용한 분석에서 JK-8과 JK-11은
Lactobacillus 종으로 확인되었으며, JK-8은 Lactobacillus plantarum으로 JK-11은
Lactobacillushilgardii로 동정되었으며,Lacbacillussp.JK-8과 Lacbacillussp.JK-11로 각각
명명되었다.
16.JK-8을 MRS 액체배지에 접종한 후 다른 농도의 NH4
+,NO2
-,NO3
-를 첨가하고 질소
제거능을 조사하였다.JK-8은 3시간이내에 100,200μM의 NH4
+와 NO2
-를 완전히 제거하였고,
400μM NO2
-는 부분적으로 제거되었다.100,200,300μM의 NO3
-는 12시간이내에 제거된 반
면에 JK-11은 일부 NH4
+,NO2
-를 제거하였고,NO3
-는 제거되지 않았다.
17.JK-8과 JK-11은 660nm에서 생장이 측정되었고,생장하는 동안 유기산을 생산하는 것
이 관찰되었다.유기산은 JK-8의 생장에 비례하여 생성되었고,lactic acid와 acetic acid는
JK-8생장 동안 중간 대사산물로 검출되었다.배양기간중에 생성된 유기산은 192.8mM lactic
acid와 43.6mM aceticacid가 형성되었으며,초기 pH는 배양 동안 감소하여 3.8로 나타났으며,
JK-11은 소량의 lacticacid와 aceticacid를 형성하였고,초기 pH는 7.0이었지만 배양 후 pH는
5.4였다.
18.5배 농축된 배양 상등액에 노출된 어병 원인 세균의 살균율은 0.5시간에서 4시간 동안
조사되었다.병원성 세균의 살균율은 분리균주의 상등액에 따라 영향을 받는 것으로 조사되었
다.V.harveyi와 V.parahaemolyticus는 JK-8과 JK-11의 상등액에 민감하여,JK-8의 상등액
에서 30분내에 각각 살균되었고,JK-11에서는 90분내에 살균되었다.Strepcoccuspyogenes와
Edwardsiellatarda는 동일한 조건에서 JK-8과 JK-11의 상등액에 노출된 후 4시간내에 완전
히 살균되었다.
19.배양 농축상등액은 어류의 질병원인 세균에 대하여 platediffusion assay 방법으로 항
균활성을 측정하였다.
13.질소와 인을 모두 포함하는 배지내에서 혼합배양에 의한 질소와 인 동시제거 실험을 실
시하였다.그 결과,400 μM NH4
+와 NO2
-는 12시간이내에 제거되었고,NO3
-는 36시간이내에
각각 제거되었으며,500μM PO4
3-도 36시간이내에 제거되었다.이 결과로 배지에 포함된 질소
와 인 제거는 혼합배양에 의한 가속화되는 것이 증명되었다.
14.양식사료에 포함된 당은 HPAEC-PAD 시스템을 이용해 분석되었다.그 결과,사료에
포함된 당은 glucose> galactose> galatosamine> mannose > fucose순으로 확인되었다.
0.2% 사료로부터 N/P는 약간 용출되는 것이 측정되었다.CK-10과 CK-13을 사료에 접종한 후
일정량의 N/P가 용출되었으며 이들 세균에 의하여 제거되는 것이 관찰되었다.혼합배양에서는
단일배양에서 보다 용출된 N/P를 효과적으로 제거하였으며,용출된 모든 N/P는 배양 84시간
이내에 완전히 제거되었다.그 결과 혼합배양에 의한 N과 P 제거는 시너지 효과 (synergic
effect)를 나타내는 것으로 확인되었으며,혼합된 Bacillussp.CK-10과 Bacillussp.CK-13은
단일 배양에 의한 것보다 질소와 인을 효과적으로 제거하는 것이 관찰되었다.
15.본 연구의 두 번째 부분에서는 여러 가지 어류 질병원인 세균에 대한 해양환경으로부터
분리된 세균에 의한 항균활성 측정과 항균물질의 특성을 조사하였다.JK-8과 JK-11균은 양식
장에서 채취한 물시료으로부터 분리되었고,MRS 배지에서 생장되었다.이들 균주는 현미경 관
찰을 통하여 그람 양성이며,간균형태의 세균임이 관찰되었고 BIOLOG 시스템을 이용한 생리
학적 분석을 통해 동정되었다.GP2 Microplate의 당 이용한 분석에서 JK-8과 JK-11은
Lactobacillus 종으로 확인되었으며, JK-8은 Lactobacillus plantarum으로 JK-11은
Lactobacillushilgardii로 동정되었으며,Lacbacillussp.JK-8과 Lacbacillussp.JK-11로 각각
명명되었다.
16.JK-8을 MRS 액체배지에 접종한 후 다른 농도의 NH4
+,NO2
-,NO3
-를 첨가하고 질소
제거능을 조사하였다.JK-8은 3시간이내에 100,200μM의 NH4
+와 NO2
-를 완전히 제거하였고,
400μM NO2
-는 부분적으로 제거되었다.100,200,300μM의 NO3
-는 12시간이내에 제거된 반
면에 JK-11은 일부 NH4
+,NO2
-를 제거하였고,NO3
-는 제거되지 않았다.
17.JK-8과 JK-11은 660nm에서 생장이 측정되었고,생장하는 동안 유기산을 생산하는 것
이 관찰되었다.유기산은 JK-8의 생장에 비례하여 생성되었고,lactic acid와 acetic acid는
JK-8생장 동안 중간 대사산물로 검출되었다.배양기간중에 생성된 유기산은 192.8mM lactic
acid와 43.6mM aceticacid가 형성되었으며,초기 pH는 배양 동안 감소하여 3.8로 나타났으며,
JK-11은 소량의 lacticacid와 aceticacid를 형성하였고,초기 pH는 7.0이었지만 배양 후 pH는
5.4였다.
18.5배 농축된 배양 상등액에 노출된 어병 원인 세균의 살균율은 0.5시간에서 4시간 동안
조사되었다.병원성 세균의 살균율은 분리균주의 상등액에 따라 영향을 받는 것으로 조사되었
다.V.harveyi와 V.parahaemolyticus는 JK-8과 JK-11의 상등액에 민감하여,JK-8의 상등액
에서 30분내에 각각 살균되었고,JK-11에서는 90분내에 살균되었다.Strepcoccuspyogenes와
Edwardsiellatarda는 동일한 조건에서 JK-8과 JK-11의 상등액에 노출된 후 4시간내에 완전
히 살균되었다.
19.배양 농축상등액은 어류의 질병원인 세균에 대하여 platediffusion assay 방법으로 항
균활성을 측정하였다.
JK-11은 소량의 lacticacid와 aceticacid를 형성하였고,초기 pH는 7.0이었지만 배양 후 pH는
5.4였다.
18.5배 농축된 배양 상등액에 노출된 어병 원인 세균의 살균율은 0.5시간에서 4시간 동안
조사되었다.병원성 세균의 살균율은 분리균주의 상등액에 따라 영향을 받는 것으로 조사되었
다.V.harveyi와 V.parahaemolyticus는 JK-8과 JK-11의 상등액에 민감하여,JK-8의 상등액
에서 30분내에 각각 살균되었고,JK-11에서는 90분내에 살균되었다.Strepcoccuspyogenes와
Edwardsiellatarda는 동일한 조건에서 JK-8과 JK-11의 상등액에 노출된 후 4시간내에 완전
히 살균되었다.
19.배양 농축상등액은 어류의 질병원인 세균에 대하여 platediffusion assay 방법으로 항
균활성을 측정하였다.pH를 조절하지 않은 JK-8의 항균활성은 낮은 pH의 의한 영향으로 관찰
되었고,pH를 조절한 배양액에서는 약간의 투명대가 관찰되었다.JK-11의 경우,pH를 조절하
-5-
지지 않은 상등액과 pH를 중성으로 조절한 상등액에서 모두 강한 항균활성이 어류 질병원인균에
대하여 나타났다.
20.중간대사 산물은 HPLC에 의해 lacticacid와 aceticacid로 잠정적으로 분석되었으며,이
들 물질은 GC-MS를 통해 확인되었다.
21.Lactobacillusspp.JK-8과 JK-11는 강한 항균활성을 나타내었는데,JK-8은 유기산에
의한 항균활성이었으며,JK-11상등액에 처리된 어병세균은 bacteriocin에 의하여 영향을 받는
것이 확인되었다.
22.JK-11에서부터 얻어진 bacteriocin의 항균활성은 radialdiffusion assay을 이용해 측정
되었다.RP-HPLC로부터 분리된 72개의 분획들 중 1번 분획에서 bacteriocin에 의한 항균활성
이 관찰되었다.JK-11로부터 유도된 bacteriocin물질은 TricineSDS-PAGE를 통해 약 4kDa
의 protein으로 확인되었다.
23.결과적으로,N/P를 제거하는 Bacillusspp.CK-10과 CK-13그리고 어류의 질병원인균
을 제어하는 Lactobacillusspp.JK-8과 JK-11은 본 연구에서 효과적으로 입증되었고,그들은
probiotics균주로서 충분한 가능성을 가진 것으로 조사되었다.
24.새우양식장 사육수 수질개선에 효과를 주는 probiotics의 종류와 농도를 조사하기 위하
여 Bacillus licheniformis,B.megaterium,B.mesentericus,Lactobacillus acidophillus 및
Nitrosomonas등 5개의 균주를 이용하여 소형수조와 대형수조에서 다양한 농도의 probiotics와
함께 새우 유생,치하 혹은 성체를 사육하고 수질변화를 조사하였다.본 실험에 사용된 유익세
균들은 사육수 내 독성의 암모니아성 질소와 아질산성 질소를 제거하여 이것을 무독성의 질산
성 질소로 전환시킴으로써 사육수 수질개선에 효과가 있는 것으로 나타났다.
25.새우양식장 현장적용실험을 위한 양식생태를 조사하기 위하여 2003년 5월～7월에 인천
시 강화도 소재 축제식 새우양식장 2개에서 사육수의 수질변화 (일반수질환경 및 영양염류)와
세균상 변화 (총세균수,비브리오균수)를 조사하고 양식새우의 기생충성 및 바이러스성 질병
실태를 조사하였다.
26.Probiotics에 의한 새우양식장 수질개선 및 질병억제 효과 조사를 위한 현장적용 실험을
실태를 조사하였다.
26.Probiotics에 의한 새우양식장 수질개선 및 질병억제 효과 조사를 위한 현장적용 실험을
위하여 2005년 6월～9월에 충남 서산에 위치한 새우양식장 2개에서 probiotics를 처리한 후 지
속적인 당밀공급으로 타가영양상태를 유지시킨 처리구와 비처리 대조구 간에 수질 변화,새우
의 생산성,질병발생율 등을 비교하였다.처리구는 대조구에 비해 새우의 질병발생율은 낮고,
새우의 체중과 생산성,생존율이 모두 높게 나타남으로써 probiotics및 타가영양양식방법이 사
육수의 수질을 개선시킴으로써 질병발생을 억제시키고 생산성을 향상시키는 것으로 확인되었
다.
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