숙성 년수에 따른 빙도차 화합물 변화와 산지 판별을 위한 화합물 분석

[상파]

Mass Spectrometry-based Metabolomics and Chemometric Analysis of Pu-erh Teas of Various Origins
다양한 산지 보이차들에 대한 질량 분석법 기반 대사체학과 화학분석

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814618310136

* 메타볼로믹스(metabolomics 대사체학)

----

= 개요

보이차는 중국에서 가장 인기있는 차 음료중 하나 입니다. 저장기간, 발효공정 및 산지는 보이차의 품질과 가격에 영향을 끼칩니다. 고분해능 질량분석(HRMS)을 기반으로한 메타볼로믹스 접근법, 계량분석을 결합한 NIR(근적외분광분석법)이 1년에서 10년간 보관된 빙도 보이 생차와 다양한 산지 차들의 수용성 대사물질 개요를 위해 이용되었습니다.

좋은 인식률의 연도 예측 모델이 확립하기 위해, 부분최소 제곱(PLS) 분석법과 요소 분석이 사용되었습니다. 차 저장기간을 식별하기 위해 사용 될 수 있는 38종의 화합물이 판별 되었고, 생차와 숙차를 구분하기 위해 사용할 수 있는 19종의 화합물이 발견되었습니다.

서로 다른 지역에서 생산된 보이차의 클러스터 분석은, 산지의 지리적 분포와 추출 구성물(우려낸 찻물) 사이의 연관성을 보여 주었습니다. 이 연구는 보이차의 식별을 위한 지침을 제공하고 건강한 차 시장을 확립하는데 도움을 줄 것 입니다.

1. 소개

보이차(Camellia sinensis var. assamica)는 당나라(기원전 700) 시기부터 중국 윈난성에서 생산되었습니다. 보이차는 아시아, 특히 중국 남서부 지방에서 독특한 풍미와 잠재적인 건강상 이익 덕분에 가장 인기있는 음료 중 하나 입니다.

보이차 시장에서는 오랫동안 이렇게 주장해왔습니다. “좋은 산이, 좋은 차를 만든다”. 이 주장은 윈난 지역은 북부가 남쪽보다 높은 산악 지대이기 때문인데, 고도의 차이가 미기후(좁은 지역내 기후)에 있어 극적인 차이를 만들어내며, 이것이 강수량과 일조량 그리고 토양 품질에 있어 영향을 끼치기 때문입니다.

따라서 산지가 다른 차는 서로 다른 특성을 보여줍니다. 많은 차산에서, 보이차를 만들기 위한 차 나무는 수령이 100년이 넘었고, 몇몇 아주 오래된 나무는 500년이 넘었습니다. 이런 오래된 나무에서 나온 차는 매우 제한적인 수량임에도 높은 수요가 있어서, 근래들어 이런 차들의 가격은 하늘을 뚫을 지경입니다.

보이차 시장에서는 “오래된 것일수록, 더 좋다”라는 오래된 격언이 있으며, 이는 두 가지 의미를 가지고 있습니다. 첫번째는 오래된 나무(고차수)가 어린 나무보다 좋다는 의미. 두번째는 보이차는 보관할수록 햇차보다 훨씬 비싼 시장가치를 지닌다는 의미입니다. 그러므로, 시장에서는 산지나 저장기간을 위조하는 가짜 차가 있습니다.

보이차는 생차와 숙차로 구분됩니다. 생차는 햇볕에 말린 잎으로 만들어지며, 그 과정은 자연적인 시들리기, 덖기, 유념, 일광건조(쇄청) 및 압병을 포함합니다. 생차는 저장과 함께 천천히 발효되며, 화학 성분은 그에 따라 변화하면서 차의 맛과 향미에 영향을 미칩니다. 반면 숙차는 45일에서 60일 정도 지속되는, 악퇴발효라 불리는 추가적인 가공절차를 갖습니다. 악퇴발효는 차의 유통기간을 연장하고, 생산 및 보관비용을 줄이는 숙성 가속화 방식으로써 고려될 수 있습니다.

탕색으로 명백하게 보여지는 발효는, 차의 품질과 향미에 극적 변화를 유발합니다. 숙차의 탕색은 검은 적색인 반면, 생차의 탕색은 보통 밝은 노란색입니다. 보이 숙차는 놀랍도록 복잡하고 비단같은 부드러움과 그윽함을 발전시키는 반면, 숙성된 생차는 녹차와 유사한 구감을 보여주지만 녹차의 불쾌감이 없으며, 숙성된 보이 생차는 수년의 보관 뒤에도 쓴 풍미를 간직합니다. 한 연구에서는 보이 생차와 숙차 사이에서 카테킨과 갈산의 함량이 유의미하게 다른 것을 나타냈습니다. 그러나 해당 연구는 더 광범위한 화합물을 조사하지는 않았습니다.

최근 몇년동안, 보이차에 대한 수요가 급격하게 증가했으며, 보이 생차와 숙차 가격 역시 따라 상승했습니다. 차의 품질과 가격은 저장기간 뿐만 아니라 생산지역와 차나무 수령에 따라 결정되므로, 어린 차나무나 낮은 등급 산지의 저렴한 찻잎을 더 높은 등급이나, 더 비싼 차로 위조하는 많은 사례가 있었습니다. 보이차 산지와 연도의 잘못된 사용은 소비자의 이익에 피해를 줄 뿐만 아니라, 차 생산자의 이익과 명성에 해를 끼칩니다.

현재까지, 차의 품질은 주로 경험이 풍부한 차 생산자와 감정가에 의해 수작업으로 행해졌습니다. 찻물 색상, 차의 향과 맛, 건조된 차잎 형태와 같은 주관적 특징이 보이차의 품질 특성을 묘사하기 위해서 사용되었습니다. 이러한 방법은 주관적이고, 일관성이 적으며, 사람의 실수가 발생하기 쉽습니다. 차의 품질은 화학성분과 직접적으로 연관되므로, LC-MS과 NIR(근적외분광분석법 near-infrared spectroscopy) 같은 최신 분석 기술이 다양한 저장기간, 산지, 생산방식을 감정하는데 있어 신뢰할 수 있는 도구로 사용 될 수 있습니다.

고분해능 질량분석(LC-HRMS)과 액체 크로마토그래피의 병용은 넓은 범위의 저분자량 화합물을 검출 할 수 있으며, 대사체학 연구를 위한 최첨단 분석 도구 입니니다. 차맛과 대사물질에 있어서 수확시기 영향, 녹차의 카테킨 함량과 카테킨의 대사물질 그리고 복전차의 미생물 발효 공정 중 생리활성물질의 변화를 조사하기 위해 적용 되었었습니다.

NIR 또한 식품 및 사료 산업에서 최종제품 품질을 평가하는데 널리 사용되었으며, 사용하기가 쉽고 최소한의 샘플만을 필요로 합니다. 차 분석에서 NIR 적용은 차 품종 식별, 지리적 원산지, 차품질 평가를 포함했었습니다.

HRMS을 기반으로하는 대사체학은 NIR과 함께 다양한 저장기간, 원산지 및 생산방식(숙차생차)를 구별 할 수 있는 강력한 도구 입니다. 이번 연구에서, 우리는 2006년 부터 2015년 까지 생산된 빙도 생차, Maguotou(*) 생, 숙차 (2011,2012,2015) 뿐만 아니라, 13곳 대표 생산 지역을 포함하여 분석했습니다. 이는 보이생차와 숙차 품질에 있어, 저장 기간과 산지뿐만 아니라 가공기술의 영향에 대한 첫 포괄적인 연구입니다.

* 馬商頭 마상두로 추정

이번 연구에서, 찻잎에서 대사물질을 추출하기 위해 메탄올이나 아세토니트릴과 같은 유기용제 대신 끓인 물을 사용하여 차를 우려내는 과정을 모방했기에, 판별된 특징 화합물들은 사람들이 일상적으로 마시는 찻물의 맛과 향에 밀접하게 연관되어 있을 것입니다..

빙도차는 윈난지역 린창시 빙도 마을에서 2006년부터 2015년까지 채엽 되었습니다, 즉 차는 같은 산지에서 10년 연속으로 수확 되었습니다. 압병된 전차는 만들어진 이후 지역에서 통상적으로 보관되었습니다. 따라서 차는 분석되기 전 1~10년 동안 보관 되었습니다. 이 샘플들은 생차의 “노차” 와 “햇차” 를 구별하기 위한 귀중한 견본을 제공합니다.

주요성분 분석(PCA), 부분최소제곱 분석(PLS), 부분최소제곱 판별 분석(*PLS-DA), 계층적 군집 분석과 같은 통계분석이 보이차의 광범위한 모음에 본질적 차이를 밝혀내는데 사용되었습니다.

* 원문 오기. Partial least squares discriminant analysis 이 맞음

이번 연구는 보이차 식별에 대한 귀중한 정보를 제공하고, 보이차 시장의 건강한 발전을 촉진하기 위한 실험 증거를 제공합니다.

2. 재료와 방법

2. 1. 재료

보이차는 운남 국색단장 国色端庄 차창, 쿤밍 Gu Yun Liu Xiang 차창, 운남 Chamasi(차시장?) 회사, Hongyi 차 아카데미에서 제공했습니다.(음표기가 엉망이라 찾지 못함..). 빙도 생차는 린창시 빙도 마을에서 100~300년 된 고수차에서 채집하여, 현지 차창에서 현지 제다방식에 따라 만들고 압병하여 자연적인 상태로 보관했습니다.

마상두 청병, 숙병은 2011, 2012, 2015 년도 분으로, 샘플 1(2016)에는 12곳 산지가, 샘플 2(2017)에는 4곳 산지가 포함되었습니다. 각각의 샘플은 전차 1개 분량입니다. 이 전차를 작은 조각으로 쪼개어 분석했습니다.

샘플 1 (2016)
1. 만전 Manzhuan	4. 이무 Yiwu	7. 맹송 Mengsong	10. 징구(경곡) Jinggu
2. 멍쿠 Mengku	5. 징아미(경매) Jingmai	8. 꺼등(혁등) Gedeng	11. 의방 Yibang
3. 유락 Youle	6. 허카이(하개) Hekai	9. 망즈(망지) Mangzhi	12. 부랑(포랑) Bulang
샘플 2 (2017)
1. 나카 Mensong	3. 허카이 Banpen	5. 허카이 laomanlong	* 세부산지
2. 부랑 Laoman'e	4. 남나 Banpozhai

2. 2 메타볼로믹스(대사체학) 분석

차 2g을 끓는 물 100ml에 1분 씻어낸 뒤, 세차한 물은 버렸습니다. 젖은 찻잎은 다른 끓는 물 100ml에 1분 동안 추출했습니다. 그 다음, 차인들이 보통 마시는 실온으로 식힌후, 필터지로 여과하고 LC-MS 분석을 위해 샘플 바이알로 옮겼습니다. 각 샘플은 이 방식으로 6개를 만들어 실험 했습니다.

(분석기기 및 기타 설명은 생략)

3. 결과와 토론

3.1 빙도 생차 대사 프로파일

보이차 업계에서 오랫동안 주장해온 “더 오래된 것이, 더 좋은 것”의 의미는, 숙성된 생차가 햇차보다 더 맛있고 더 비싸게 판매 된다는 것을 의미합니다. 그렇기에 햇차(새제품)와 노차의 구분은 매우 중요합니다.

2006년부터 2015년까지 동일 지역에서(운남지방 린창시 빙도마을, 중국) 채엽, 생산된 빙도차 모음을 구한 것은 큰 행운 입니다. 이 보이차는 숙차가 아니며, 자연적으로 1~10년간 보관되었습니다. 이 샘플들은 보이차 품질에 있어 저장 기간의 영향을 평가하는 탁월한 모델을 제공했으며, 저장 기간이 다른 차들을 예측하고 구분하는데 사용 될 수 있습니다.

다른 연구들은 다양한 유기용매(아세톤등)을 사용하여 추출했었고, 찻물이 실제로는 짧은 시간 동안 뜨거운 물에 우려지는 것을 반영하지 않았습니다. 따라서 보이차의 맛과 향미 배후에 있는 화학물에 대한 실질적인 관점에 가깝게 하기위해, 우리는 뜨거운 물만을 추출 용매로 사용했습니다. 추출 시간은 사람들이 실제 마시는 방식과 가깝게 하기 위해 1분으로 줄였습니다.

* 그동안 5분 넘게 뜨거운 물에 담그거나 유기용매로 추출하는 방식으로 실험을 했기 때문에, 실제 생활에서 빠르게 우려내어 마시는 방식과는 차이가 있었음

전통적으로 보이차는 음용하기 전 세차를 합니다. 즉 찻잎을 세척하기 위해 말린 찻잎에 뜨거운 물을 잠깐 넣은 뒤, 그 물을 버립니다. 젖은 찻잎을 우려내기 위한 뜨거운 물을 추가로 부은 후에, 마시기 위한 차가 준비됩니다.

분석결과 세차한 물과 우린 물에 유의미한 차이가 없었습니다. 따라서 우리는 첫 우림을 이용해서 찻잎의 먼지와 오염물질을 제거하고 2번째 우려낸 찻물을 분석에 이용했습니다. 유사범위를 벗어낸 1개(2011년) 표본을 제외한, 나머지 59종 표본의 PLS는 어린 차와 숙성된 차의 명확한 차이를 보여주었습니다.

* 빙도차 년도별 표본(2016 조사). 차이가 있으나 시간이 갈수록 유사성을 띄게 되며 일정 시기별로 묶이는 것을 확인 가능함. 2015년도의 특이성은, 다른 해에 동일하게 검사한 자료가 있어야 첫해의 특이성인지 해당 년도 외부요인(채엽사정등)인지 명확한 답을 줄 수 있을 것으로 보임.

숙성된 차는 두 군집으로 모이는 것이 보여지는 볼 수 있습니다. 첫번째 군집은 2009~2013, 두번째 군집은 2006~2008년 입니다. PLS 모델은 상관계수(R2) 0.967, 교차검증 상관계수(Q2) 0.93, 평가치의 평균 제곱근 오차(RMSEE) 0.546을 가져, 거의 완벽에 가까운 적합도와 훌륭한 예측 능력을 나타냈습니다.

판별된 화합물은 군집분석에 따라 5가지 그룹으로 배치됩니다.

* 이전 자료에서 보았듯, Q(퀘르세틴), K(캠퍼롤)이 분해에 따라 낮아짐. 오른쪽 도표는 2006~2015 표본 수치.

클러스터Ⅰ은 퀸산(quinic acid), 팔미트 아미드(palmitic amide)등을 포함합니다. 이 화합물들은 저장 후 2년 동안 급격히 증가하였고, 이후에도 비교적 안정적으로 유지되었습니다. 이 중 Xestoaminol C 는 역전사 효소 억제제이며 기생충과 미생물에 대한 광범위한 활성을 보여줍니다.이 화합물은 햇차와 숙성된 차를 구분하는데 사용 될 수 있습니다.

클러스터 Ⅱ는 L-페닐알라닌(L-phenylalanine), L-루신(L-leucine)등을 포함하며, 이 화합물들은 보관 후 첫 8년 동안 안정적으로 유지되다가, 9~10년 시기에 크게 증가했습니다. 따라서 이 화합물은 차의 나이를 판별하는데 사용될 수 있습니다.

클러스터 Ⅲ는 클러스터Ⅰ과는 반대되는 경향을 보였습니다. 화합물들은 첫 2년간 급격히 감소했으며, 이후 안정적으로 유지되었습니다. 따라서 이 화합물 또한 숙성된 차와 햇차를 구별하는데 사용할 될 수 있습니다. 클러스터 Ⅲ에 포함된 화합물은 테오갈린(theogallin), 클로로겐산(chlorogenic acid), 카테킨류(catechins), 플라보노이드류(flavonoids), 플라보놀류(flavonols) 안토시아닌류(anthocyanins)등 입니다.

테오갈린은 음식의 맛을 더하고 클로로겐산은 항산화 작용을 하는데, 둘 모두 차의 쓴맛에 기여합니다. 이 화합물의 함량은 저장 후 감소되었는데, 이것이 아마 숙성된 차가 신차보다 일반적으로 쓴 맛이 덜 나는 이유일 것입니다. 2,5-dihydroxybenzaldehyde는 항균 작용을 하는 것으로 입증되었습니다.

이번 연구에서 검출 된 플라보노이드에는 케르세틴-3-글루코시드(quercetin-3-glucoside), 미리세틴-3-글루코시드(myricetin 3-glucoside), 케르세틴(quercetin), 탁시폴린(taxifolin), quercetin 3-O-rhamnosyl-galactoside가 포함되었습니다. 플라보놀은 아스트라갈린(astragalin)이 포함되어 검출되었습니다.

검출된 안토시아닌은 procyanidin B2가 포함되었습니다. 이 성분은 항산화 활성과 카르보닐(carbonyl) 소거기능을 갖고 있습니다.

카테킨은 epicatechin monogallate(ECG. mono는 통상 생략), epigallocatechin gallate(EGCG), epicatechin(EC), epigallocatechin(EGC)을 포함하여 검출 되었습니다. 카테킨은 강한 항산화력을 가지고 있으며, 카테킨 농도 감소가 숙성된 차에 있어서 항산화력 감소의 원인입니다.

클러스터 Ⅳ는, 클러스터Ⅱ와 대조적으로 보관 첫 9년간 천천히 감소하였고, 10년째 되는 해에 급격히 감소되는 것이 관찰되었으며, 이 클러스터의 화합물에는 피페콜산(pipecolic acid), 7-methylxanthine, 콜린(choline), 테오브로민(theobromine), L-아르기닌(L-arginine), L-테아닌(L-theanin)등을 포함합니다.

7-methylxanthin과 콜린, 테오브로민은 알칼로이드에 속하며 차의 쓴 맛에 기여합니다. L-테아닌은 차의 감칠 맛과 연관이 있습니다. 이 네 가지 성분 함량의 감소는 숙성된 차의 쓴맛과 감칠맛을 감소 시키는데 기여합니다. 이것 또한 햇차와 숙성된 차를 구별하는데 사용 될 수 있습니다.

이에 따라서 우리는 빙도 햇차와 숙성된 빙도차를 판별할는데 사용될 수 있는 일련의 화합물들을 판별했습니다.

* 시기마다 줄어들거나 늘어나는 성분으로 인해 차 숙성 나이를 판별할 수 있음. 위에 언급하는 성분들은 약리적 성분임.

알카로이드는 차의 쓴맛에 기여하는 중요성분입니다. 차의 알카로이드는 카페인, 테오브로민(이뇨,혈관확장), 테오필린(이완,혈관확장)을 포함합니다. 보통, 마른 찻잎에서 카페인은 다른 두 성분보다 10배 가량 높습니다.

빙도 찻잎 카페인 함량은 9.39mg/g(2013년)에서 10.78mg/g(2011년) 까지 입니다. 흥미롭게도 보통은 카페인 함량이 저장에 따라 감소한다고 믿어지더라도, 저장 기간이 다른 차 사이에서는 별다른 차이점이 발견되지 않았습니다.

* 자연적 숙성이나 일반적인 숙차 공정으로 카페인 분해는 어려움. 관련자료 참조.

이 결론은 숙성된 차를 우려낸 물의 쓴맛이 줄어드는 것은, 카페인의 감소에서 유래한 것이 아니며, 테오갈린(*)과 클로로겐산의 꾸준한 분해가 숙성된 차의 쓴 맛 감소에 기여하는 것 일 수 있음을 보여줍니다.

*원문의 theagallin은 오기.

3.2 유리 아미노산 분석

빙도차의 유리 아미노산 농도는 AccQ-Tag 시약으로 유도체화 한 후 LC-MS를 사용하여 분석 되었습니다.

L-발린(L-valine), L-이소루신(L-isoleucine), L-페닐알라닌, L-아스파라긴(L-asparagine)은 저장 이후 증가 한 반면, L-시트룰린(L-citrulline), L-아르기닌, L-테아닌, 하이드록실-L-프롤린(hydroxyl-L-proline)은 저장 이후 감소했습니다. 따라서 이들 아미노산들 또한 저장기간을 추적하는 표식으로 사용할 수 있습니다.

유리 아미노산은 또한 향미 화합물입니다. 쓴맛 아미노산은 L-티로신(L-tyrosine), L-이소루신, L-루신, L-페닐알라닌, L-발린을 포함합니다. 단맛 아미노산은 L-세린(L-serine), 글리신(glycine), L-알라닌(L-alanine), L-트레오닌(L-threonine), L-프롤린(L-proline)을 포함합니다. 감칠맛 아미노산은 L-테아닌, 글루탐산(glutamic acid), L-아스파르트산(L-aspartic acid)을 포함합니다.

이 연구에서 쓴맛 아미노산은 티로신을 제외하고는 저장기간 동안 유의미하게 증가했습니다. 단맛 아미노산의 경우 글리신과 L-알리닌은 약간 감소한 반면, L-프롤린은 크게 증가했습니다. 감칠맛 아미노산의 경우, 생차 보관 중 L-테아닌이 약간 감소한 것을 제외하고는 유의미한 변화가 관찰되지 않았습니다.

메타볼로믹 프로파일링 접근법 뿐만 아니라 Accq-Tag 유도체화 접근법도 유리 아미노산의 함량을 측정 할 수 있는 반면, 메타볼로믹 프로파일링 접근법은 교정 표준이 없기 때문에 절대 정량 대신 추세 변동만을 제공할 수 있습니다. 그러나 두 방법 모두 유사한 추세 변동을 제공하여, 연구에 사용된 메타볼로믹 접근법이 유효함을 나타내었습니다.

3.3 근적외선 분광학 분석

2006년부터 2015년까지 빙도차의 NIR 스펙트럼을 OPUS 소프트웨어로 분석했습니다. 분해 알고리즘에 의한 정성분석(qualitative analysis) 모델을 확립하기 위해 각 년도 표본(6개) 중 4개가 임의로 선택 되었습니다.

2014년과 2015년의 보이차(저장기간 1~2년)는 점수표에서 다른 표본과 완전히 분리 되었습니다. 이 결과는 메타볼로믹 PLS 결과와 일치하며, 햇차와 숙성된 빙도차 사이에 명백한 차이가 있음을 나타내고 있습니다.

각 년도 남은 차 표본 2개를 사용하여 이 모델의 인식 능력을 테스트 하였고, 표본의 85%를 올바르게 판별할 수 있었습니다. 나머지 15% 경우 정확한 생산년도는 아니였지만, 틀린 연도에 배치되는 것 역시 아니였습니다. 따라서 이 근적외선 분광학 모델은 상당히 좋은 비율의 예측으로, 빙도차의 생산연도를 판별하기 위해 사용될 수 있습니다.

* 전체가 아닌 비슷한 기후내에서 숙성된 빙도차 한정 예측

3.4 생차와 숙차의 메타볼로믹 프로파일링

생차와 숙차는 찻잎과 탕색에 있어서 시각적으로 달랐습니다. PCA 점수에서 생차 군집은 81.5% 숙차 군집은 6.2%를 보임으로써, 보이차의 대사물질에 있어서의 발효의 영향은 저장 기간보다 훨씬 컸습니다.

2015년도 마상두 차에서 19 종의 다른 화합물들이 판별 되었으며, 이 화합물들은 생차와 숙차를 구분하는데 사용될 수 있었습니다. 숙차에서는 N2-succinyl-ornithine, L-발린, 테오브로민 함량이 높았습니다. 생차에서는 3-O-p-coumaroylquinic acid, enol-phenylpyruvate, 에피카테킨(EC), L-페닐알라닌, 피페콜산, L-루신, 테오갈린, 갈산, P-쿠마르산(p-coumaric acid), L-테아닌, L-글루타메이트(L-glutamate), 퀴닉산, 자당(sucrose), 콜린, L-아르기닌, 에피갈로카테킨(epigallocatechin)이 높았습니다.

이 19 종 화합물의 변화 추세는 2011, 2012년 생산된 마상두 차와 유사했으며, 다시 한번 발효의 영향이 보관 기간 보다 크다는 것을 나타냈습니다.

이전 연구들은 신선한 찻잎의 발효 동안, 카테킨은 산화되어지고 테아플라빈(3~6%)이나 테아루비긴(12~18%)같은 더 큰 폴리페놀 분자(이량체 또는 중합체)로 응축 됩니다. 이 폴리페놀 화합물들은 홍차의 쓴맛과 어두운 색상의 원인이 됩니다.

이번 연구에서 발효된 마상두 숙차의 색상은 발효되지 않은 생차보다 어두웠으며, 에피카테킨(EC)과 에피갈로카테킨(EGC)을 포함하는 카테킨의 함량은 생차에서 높아서, 발효 동안 카테킨의 분해를 나타냈습니다. 우리는 또한 자당의 함량이 생차에서 높은 것을 주목했는데, 이것은 발효 공정 동안 용해성 당이 미생물에 의해 미생물 탄소의 주요 공급원으로 이용되기 때문입니다.

3.5 다양한 산지 보이 생차에서의 메타볼릭 프로파일링

보이차 품질은 많은 요인에 의해 영향을 받게 되며, 중요한 요인 하나는 산지입니다. 지역은 지역 기후조건에 영향을 미치며 날씨는 보이차의 품질에 큰 영향을 갖습니다. 이에, 우리는 보이차 품질에 있어서 산지의 영향을 조사하기 위해, 전형적인 보이 생차 표본 두 세트를 분석했습니다.

첫번째 표본 세트는 12 종류 차들로 구성되었으며, 윈난 지방 내 100,000 평방 킬로미터에 걸친 보이차 산지에서 수집 되었습니다. 두번째 세트는 멍하이 지방 내 차산 네 곳에서 나온 5 종류 차를 포함합니다. 첫번째 표본 세트는 3개 도시/자치현을 포함하며, 2번째 표본 세트에 비해 20~30배 넓은 크기 입니다. 따라서 두 표본 세트는, 보이차의 품질에 있어서 산지가 영향을 미치는 정도를 평가하기 위한 다른 수준의 관점을 제공했습니다.

LC-MS를 사용하여 대사물을 분석한 후에, 우리는 계층 군집 분석(HCA)과 부분최소제곱 판별분석을 사용하여 서로 다른 산지 간에 본질적인 관계를 밝혔습니다.

* 유사성에 따라 가까운 순으로 묶임. (표본이 진짜임을 가정함)

  왼쪽부터 허카이(1) / 유락, 망즈, 꺼등, 의방, 부랑(2) / 징마이, 만전, 맹송 (3) / 멍쿠, 이무, 징구(4)

* 예를 들면, 성분상 멍쿠는 징마이보다는 이무와 가까운데, 그 징마이를 꺼등과 놓고 비교한다면 징마이가 꺼등보다 멍쿠와 가깝습니다. 한편 허카이는 다른 차들과 완전히 동떨어져서 있어서, 멍쿠, 꺼등, 허카이를 놓고 비교해보면, 멍쿠와 허카이 보다는 멍쿠와 꺼등이 보다 가깝다는 뜻 입니다.

첫 표본 세트의 12종 차 표본은 HCA plot에서 4개의 군집으로 나누었습니다. 1번 군집은 단지 허카이 차 하나 뿐이였습니다. 2번 군집은 유락, 망지, 꺼등, 의방, 부랑 차가 포함되어 있었습니다. 3번 군집은 징마이, 만전, 맹송 차가 포함되어 있었습니다. 4번 군집은 멍쿠, 이무, 징구 였습니다

허카이산 차는 HCA plot 뿐만 아니라, 탕색에 있어서 다른 차들보다 밝았습니다. 다른 3개 군집인 차들은 다른 지역에서 생산되었음에도 불구하고 함께 묶였는데, 이들 사이에는 어떤 유사성이 있는 것으로 나타났습니다.

차산의 지리적 분포와 역사를 면밀히 살피는 것은, 이 차들 사이에서 어떤 연관성을 드러냅니다. 멍쿠산은 징구산과 인접해 있으며, 이 두 차산에서 만들어진 차는 군집 4로 묶여있습니다. 징마이와 맹송은 란찬강 서쪽 사면에 있으며, 군집 3으로 묶였습니다. 유락, 만지, 꺼등, 의방산은 란창강 동쪽 사면에 위치하며, 이들 4개 차산은 서로 가깝고 차들은 군집 2로 묶였습니다.

* 멍하이현. 란창강 좌우로 나뉘는 차산들.

이러한 결과들은 차의 대사물질과 산지의 지리적 분포 간에 강한 연관성이 있음을 보여줍니다. 징구 차는 멍쿠에 있는 나무에서 재배되었으며, 맛이 비슷하고 군집 4로 묶였습니다. 따라서 대사체학적 접근은 다른 산지에서 나온 보이차의 유사성과 차이점을 반영 할 수 있으며, 이러한 차이는 또한 주관적으로 구분이 가능한 차맛과도 연관 되어있었습니다.

이 12종 차 표본은 보이차 산지의 대표적인 산에서 수집 되었습니다. 이 차들 간 차이점과 유사점은, 거시적 수준에서 보이차의 품질에 대한 기후, 고도, 기타 다른 많은 자연적인 요소의 영향을 반영합니다.

두번째 표본 세트는 훨씬 작은 지역을 다루었으며, 이번은 하나의 단독 현 입니다. 5종의 차 표본이 멍하이 지역 4개의 다른 차산에서 수집 되었습니다. 4개 산은 서로 약 30~50 킬로미터 정도로 매우 가깝습니다.

PCA 점수는 부랑산 Laoman'e(노만아)가 다른 4개의 표본과 명백하게 분리되어 있는 것을 보여주었습니다. 지도에서 부랑산은 멍하이 현 최남단에 위치하고 있으며, 산은 미얀마 국경에 가까운데, 실제 부랑산에서 재배되는 차나무는 미얀마에 있는 차 나무와 가까웠던 반면, 다른 3개 차산의 차들은 중국내 주류인 품종으로 나타났습니다.

* 노만아(원모양) 지역만 따로 묶여짐.

따라서 노만아 차는 다른 차들과 주로 품종 차이 때문에 달랐습니다. 다른 4개 표본에 있어서는, 우리는 PCA 점수표에서 차의 상대적 위치가 차산의 지리적 위치와 일치함을 발견했습니다.

이와 같이 비록 차가 같은 현에 서로 단지 30~50 킬로미터 밖에 떨어져 있을지라도, 산지와 보이차의 품질/맛 사이에서는 연관성이 있었습니다. 이러한 결과는 지역 미기후 또한 보이차의 품질과 맛에 영향을 미친다는 것을 나타냈습니다.

* 매우 좁은 지역 내에 위치한 차산들 사이에서도 찻잎 성분에 차이점이 나타났으며, 이는 좁은 지역내 날씨 및 환경 차이 마저도 찻잎 성분에 영향을 주어 각 차산 특유의 맛을 발생 시켰다는 증거가 됨.

이 두 표본 세트로부터 31종의 차별적인 화합물이 판별되었는데, 이는 다양한 산지 차를 구별하는데 사용 될 수 있을 것 입니다. L-테아닌, 카페인, 테오브로민, 에피카테킨은 그들의 높은 VIP(독립 변수 중요도) 값으로 나타난 것처럼, 이 차들의 차이점에 있어 가장 큰 기여를 가졌습니다.

* 즉 이 네 성분 구성이 산지에 따른 차들 간 성분 차이에 있어서, 가장 큰 차이점을 나타냈다는 뜻.

허카이산 차 탕색은 다른 차들보다 훨씬 밝은 색을 가졌으며, 계피산 메틸(methyl cinnamate), 피페콜산, L-페닐알라닌, L-글루타메이트, L-테아닌, 4-(1-Guanidino)부티르산(butyric acid), L-아르기닌, L-류신, 카페인, 테오브로민, 콜린, P-쿠마릭산의 함량은 허카이산 차가 다른 차들에 비해 훨씬 낮았습니다. 반면 항산화 화합물 예를들어 ECG, EC, 프로시아니딘 B2(procyanidin B2)는 훨씬 높았습니다. 더 높은 항산화 화합물의 함량은 허카이 차의 더 높은 항산화 활성을 나타냅니다.

탕색의 차이는 아마도 이러한 화합물 함량의 차이와 또한 연관되어 있을 것입니다. 종합하면, 이 31종의 화합물은 다양한 보이차 산지를 구분하는 표식으로 사용될 수 있습니다.

* 산지에 따라 찻잎 내 화합물의 차이가 있으며, 이러한 차이가 탕색의 차이를 만들어 낸다는 뜻. 위에 언급한 허카이 차는 다른 차들에 비해 항산화 성분이 높지만, 기타 성분들이 낮아 밝은 탕색을 만들어냄.

4. 결론

UPLC-HRMS 기반 대사체학과 NIR 방식이 다양한 생산년도 보이차의 분석을 위해 사용되었습니다. 결과 자료는 저장 기간이 다른 보이차를 구별하기 위한 예측 및 검증 모델을 수립하기 위해 사용되었습니다. PLS 모델은 거의 완벽하게 맞았고 우수한 예측 능력(R2= 0.967, Q2= 0.93)을 보여주었습니다. NIR 모델은 85%로 식별 할 수 있었고 오탐지를 하지 않았습니다.

우리는 서로 다른 연도 빙도 차를 구별하기 위해 사용될 수 있는 38종 특성 화합물을 판별했습니다. 그 중 카테킨, 플라보노이드, 플라보놀, 안토시아니딘(anthocyanidins. 안토시아닌 당 이외부분) 및 기타 화합물들은 저장기간 동안 감소한 반면, 지질, 퀴닉산, 2-octanone 및 기타 화합물들은 증가 되었습니다.

또 다른 흥미로운 결과는 카페인 함량이 10년의 보관기간 동안 별다른 변화를 보이지 않았다는 점 입니다. 빙도 차의 아미노산 함량은 메타볼로믹 접근법과 AccQ-Tag 유도체화 접근법 둘 모두로 조사되었으며, 두 방식 결과 모두 서로의 결과에 잘 일치했습니다

마상두 생차와 숙차 분석은 발효 공정이 차 화합물의 함량에 두드러진 영향을 주는 것을 보여주며, 생차와 숙차 간 차이는 저장 기간의 차이보다 컸습니다. 여러 산지 보이차의 군집 분석은 찻물의 성분과 그 지역의 지리 분포와의 연관성을 보여주었습니다.

거시 환경(macro-environment)과 미시 환경(micro-environment) 모두 차의 품질과 맛에 영향을 줍니다. 추가적으로 우리는 여러 차산에서 나온 다양한 차들을 구분하는데 사용 할 수 있는 31종의 화합물을 발견했습니다. 그중에서 테아닌, 카페인, 테오브로민, 에피카테킨(EC)이 가장 높은 기여도를 보였습니다

이 연구는 보이차의 품질 관리 및 평가에 대한 실험적 증거를 제공하여, 가짜 및 불량차에 대한 대처에 도움을 주어 건강하고 발전하는 차시장 건설에 도움을 줄 것 입니다.

요점

- 메타볼로믹스 접근법은 보이차를 인증하는 중요 화합물을 밝혀냈습니다.

- 저장기간이 다른 보이차는 서로 다른 대사 프로파일을 보여줬습니다.

- 보이차 생산년도 확인을 위한 예측모델을 확립했습니다.

- 산지와 대사 프로파일에는 강한 연관이 있었습니다.

------------------

요약

보이차 가격이 급등함에 따라 원산지나 숙성기간을 속이는 경우가 많아졌으며, 이에 사람의 오감을 이용한 평가보다 명확한 자료가 필요해졌습니다. 따라서 미량 화합물을 분석하기 위해 현대적인 기술이 사용되었고, 특히 동일 지역(빙도)에서 채엽되어 그곳에서 자연적으로 1~10년간 보관된 표본을 확보함으로써, 기존 주요 성분만이 아니라 찻잎내 다양한 성분들이 저장 기간에 따라 줄어들고 늘어나는 것을 확인 할 수 있었습니다.

예전부터 대평님께 찻자리에서 차가 보관 후 특정 년 단위로 크게 바뀐다는 이야기를 들었습니다만, 실제로 2년, 10년과 같은 특정 시기에 급격히 감소하거나 증가하는 성분이 확인 되었습니다. 화합물은 차맛과 탕색을 만들어내는 성분이기에 이 시기를 기점으로 차맛, 탕색이 크게 바뀌는 것은 명백한 사실로 보입니다.(다만 저장환경에 따라 발효 정도가 달라지므로, 이 2년 10년은 빙도 지역내 빙도차 보관 기준입니다)

또한 여러 차산 찻잎을 분석 한 결과, 가까운 지역은 어느정도 비슷한 성분 구성을 지녔지만, 한편으로는 매우 좁은 지역내에서도 날씨와 환경 차이에 의해 각 차산의 특성을(즉 화합물 구성 차이) 만들어 내는 것으로 확인 되었습니다. 앞서 언급하였듯, 실질적으로 이 화합물의 차이가 탕색과 맛에 있어서 차이를 만들어 내기 때문에, 이는 기존 관능검사로 구분하는 것과 동일한 의미라 하겠습니다. 따라서 찻잎의 화합물 구성을 판별하면 차 산지를 특정할 수 있는 것으로 확인 되었습니다.

재밌는 점은 부랑산 노만아 지역의 경우 미얀마에서 재배하는 차의 품종과 가까운 것으로 나타나, 일반적인 중국내 품종을 재배하는 다른 여러 차산들과는 다른 특징을 보여주었습니다.

언급되지는 않았지만, 성분의 변화는 이와 연관된 보이차내 미생물의 분포 변화에도 연관이 있을 것으로 생각 됩니다. 또한 숙성 정도에 따른 생리활성 화합물(약용 물질) 함량 차이는, 숙성 정도에 따른 인체 도움 측면이 다를 것으로 보입니다.

끝. V 1.2.0

* 가끔 오류 발견시 수정을 합니다. 따라서 본문 복사나 스크랩을 하지마시고 필요하신 경우 링크를 해주시면 감사하겠습니다.

[청연]

어렵지만 끝까지 읽음~ㅎ

[상파]

한 문장씩 차근차근 읽어보시면, 실제로 그리 어렵지 않으실 것 같습니다.

[청연]

ㅎ~넵

[현월]

감사합니다

[상파]

일독 감사합니다.

[동 자 승]

감사합니다..늘 读书 。。

오늘도 즐차 하십시오

[상파]

늘 감사합니다.

[마기]

오래된 차가 쓴맛이 덜하니 카페인도 줄어들 것이라 생각했는데 아니었다는 결과수치로 보니 이해가 더 빨리 되네요. 가격대비 생각해보면 값비싼 노차를 굳이 찾아마셔야 하는 이유는 없는 것 같습니다. 잘보았습니다.

[상파]

몇번 언급하기는 했습니다만, 카페인은 안정적인 물질이라 특별한 공정이 아니면 제거가 어렵습니다. 또한 노차의 가치는 카페인 제거에 있는 것이 아니라, 세월 변화에 따른 재현하기 어려운 미량원소, 희귀성에 따른 수요등에 의해 결정되는 것이기 때문입니다.

카페인은 물론 쓴맛을 나타내는 주요 성분이긴 합니다만, 카페인만이 차의 주요 쓴 맛 요소는 아닙니다. 그리고 이 자료의 요점은 카페인이 아니라, 시간 경과에 따른 특정 성분 카테고리의 변화 경향과 지역에 따른 차이 입니다.