전립선암에서 민들레 뿌리와 레몬 그라스 추출물의 효과

[제우스]

요약

많은 기존 화학 요법은 치료 특이성이 부족하여 부작용을 나타내어 장기간 사용에 적합하지 않습니다. 자연 건강 제품은 잘 견디고 섭취하기에 안전하며 일부는 특히 항암 효과를 위해 제약 용도로 사용됩니다. 우리는 이전에 민들레 ( Taraxacum officinale ) 뿌리와 레몬 그라스 ( Cymbopogon citratus ) 의 항암 효능을보고했습니다.) 추출물. 그러나 전립선 암에 대한 이들의 효능과 표준 화학 요법과의 상호 작용은 보조 요법에 적합한 지 여부를 결정하기 위해 연구되지 않았습니다. 성공하면 이러한 추출물을 화학 요법 제와 함께 사용하여 약물 관련 독성 위험을 최소화하고 치료 효과를 높일 수 있습니다. 민들레 뿌리 추출물 (DRE)과 레몬 그라스 추출물 (LGE) 모두 선택적 항암 활성을 나타냄을 입증했습니다. 중요한 것은, 화학 치료제 탁솔 및 미 톡산 트론에 DRE 및 LGE를 추가하는 것이 개별 화학 요법 단독 치료와 비교할 때 세포 사멸 유도를 향상시키는 것으로 결정되었습니다. 또한 DRE와 LGE는 경구 투여시 전립선 암 이종 이식 모델에서 종양 부담을 크게 줄일 수 있었으며, 잘 견디는 동시에. 따라서, 보조 요법에서 이러한 잘 견디는 추출물의 구현은 전립선 암 치료에 대한 선택적이고 효과적인 접근법이 될 수 있습니다.

1. 소개

전립선 암은 전 세계 남성들 사이에서 가장 흔하게 진단되는 암 중 하나로 남아 있으며, 새로운 진단 5 건 중 1 건을 차지합니다 [ 1 ]. 전립선 특이 항원 검출 방법 [개선 포함한 전립선 암 검출 발전 2 ] 기능적 MRI 기술 [ 3 , 4 ]로 인해 조기 진단 및 질병의 치료 감소 사망률을 초래했다. 그러나 전립선 암 관련 사망은 후기 진단 및 전이성 거세 저항성 단계로의 진행과 관련이 있습니다 [ 5 ]. 이 단계에서 일반적인 치료 방법은 미 톡산 트론과 도세탁셀 [ 5 ] 과 같은 1 차 요법을 포함한 화학 요법을 포함 합니다.

현재 전립선 암 치료에는 화학 요법, 방사선 요법, 호르몬 요법, 냉동 수술이 포함됩니다 [ 6 ]. 암세포의 취약성을 표적으로 삼아 세포 사멸이라고도 알려진 프로그래밍 된 세포 사멸을 유도하는 많은 화학 요법 치료 방법이 개발되었습니다 [ 7 , 8 ]. 불행히도 이러한 치료법이 효능을 보였지만 이러한 치료를받는 환자들에게서 많은 부작용이 관찰되었습니다 [ 6 ]. 예를 들어, 미 톡산 트론 치료의 사용에서 심장 독성이 관찰되었습니다 [ 9 , 10]. 이러한 부작용은 암 치료의 비특이적 특성으로 인해 건강한 비 암성 세포를 표적으로 삼을 수 있습니다. 그러나 공격적인 전이성 암은 화학 요법 치료에 의한 관해 후 지속적인 재발의 위협이됩니다. 무작위 3 상 시험에서 도세탁셀과 함께 안드로겐 박탈 요법이 전립선 암 환자의 무 재발 생존율을 향상시키는 것으로 나타났습니다 [ 11 ]; 화학 요법의 장기간 사용은 부주의 한 부작용으로 인해 매우 바람직하지 않습니다. 따라서 치료 관련 독성을 피할 수 있고 장기적으로 사용할 수있는 치료 방법의 개발이 절실히 필요합니다.

암 치료에서 자연 건강 제품 (NHP)의 잠재력은 잘 견딜 수 있고 장기간 사용할 수있는 흥미로운 옵션을 제시합니다. NHP는 의약 적 특성을 나타내는 식물에서 추출한 물질입니다 [ 12 ]. 흥미롭게도, 현재의 화학 요법 화합물의 많은 예를 들면, 식물성 재료로부터 분리되어, 태평양 주목 나무로부터 파클리탁셀 (탁솔 그렇지라고도 함) ( 주목의 brevifolia ) 껍질 추출물 [ 13]. 내약성이 좋고 암세포에 대한 선택적 독성이 있으며 암세포의 여러 취약성을 표적으로 삼는 식물 추출물이있을 수 있습니다. 민들레 뿌리, 레몬 그라스, 롱 페퍼, 히비스커스 추출물에 대한 우리의 연구는 이러한 NHP가 암세포에서 선택적으로 세포 사멸을 유도 할 가능성이 있음을 보여주었습니다 [ 14 – 17 ]. 이 추출물은 또한 널리 그리고 전통적으로 식품 또는 의약품으로 사용되었습니다 [ 18]. 따라서 이러한 추출물은 내약성이 뛰어나고 암 완화를 예방하는 데 도움이되는 장기 섭취 가능성이 있습니다. 대장 암, 백혈병 및 림프종에 대한 DRE 및 LGE에 대한 연구를 수행하여 높은 수준의 성공을 거두었지만 전립선 암에 대한 구체적인 영향은 아직 조사되지 않았습니다. 또한 DRE와 LGE와 표준 암 치료의 상호 작용은 아직 연구되지 않았습니다.

민들레 ( Taraxacum officinale ) 뿌리는 전통적으로 중국, 아라비아 및 아메리카 원주민 전통 의학에서 소화기 질환을 포함한 암 치료를 목적으로 사용되었습니다 [ 19 ]. 레몬 그라스 ( Cymbopogon citratus )도 전통적으로 사용되었으며 많은 질병에서 항 염증, 항균 및 라디칼 소거 항산화 특성을 보여주었습니다 [ 20 – 22 ]. 앞서 언급했듯이이 두 추출물은 결장암, 백혈병 및 림프종 세포에서 조사되었지만 전립선 암에 미치는 영향은 아직 밝혀지지 않았습니다 [ 14 , 15 , 17 , 23]. 우리의 목표는 DRE와 LGE를 조사 하여 in vitro 및 in vivo 에서 전립선 암 세포 에서 세포 사멸을 유도하는 능력을 평가하는 것이 었습니다 . 더 중요한 것은 보조 요법에서 잠재적 인 사용을 평가하기 위해 DRE 및 LGE와 현재의 화학 요법의 상호 작용을 평가하고 싶었습니다.

이 연구에서 우리는 수용성 DRE와 에탄올 LGE가 용량과 시간에 따라 전립선 암에서 세포 사멸을 유도 할 수 있음을 보여주었습니다. 또한, 우리는 두 치료 모두 전립선 암에 대해 선택적이며 정상적인 건강한 세포에 큰 영향을 미치지 않음을 입증했습니다. 중요한 것은 DRE와 LGE가 전립선 암에 대해 현재의 화학 요법 제 (즉, 화학 요법의 효능을 향상시킬 수 있음)와 긍정적 인 상호 작용을 나타내는 것을 처음으로 보여 주었다는 것입니다. DRE 및 LGE의 효능은 면역 손상 마우스의 전립선 암 이종 이식에서 추가로 입증되었으며, DRE 및 LGE의 경구 투여에 의한 종양 부담 감소를 보여줍니다. 이러한 결과는 DRE 및 LGE가 현재 치료에 대한 실행 가능한 대안으로서의 잠재력과 보조 요법에서의 유효성을 뒷받침합니다.

2. 재료 및 방법2.1. 민들레 뿌리 수성 추출 및 레몬 그라스 Ethanolic 추출

아시아 민들레 ( Taaxacum officinale ) 뿌리는 Premier Herbal Inc. (Toronto, ON, Canada)에서 입수했습니다. 꽃은 커피 분쇄기를 사용하여 미세한 분말로 분쇄되었습니다. 분말을 끓인 이중 증류수 (ddH 2 O) (잎 분말 1g 에서 ddH 2 O 10mL까지 )에서 60 ° C에서 3 시간 동안 추출했습니다 . 추출액은 치즈 클로스를 통해 실행하고 0.45과 진공 여과에 이어 P8 굵은 필터 중력 여과를 통해 여과시키고  μ의 m 필터 (PALL, 생명 과학, VWR, 미시 ON, 카탈로그 번호 28148-028). 물 추출물을 -80 ° C에서 동결하고 동결 건조기를 사용하여 동결 건조한 후 ddH 2 에서 재구성O는 100mg / mL의 최종 스톡 농도를 얻기 위해. 사용하기 전에, 물 추출물 0.22 통과시켰다  μ의 생물 안전성 캐비닛 m 필터 (Sarstedt의, 몬트리올, 캐나다, 카탈로그 번호 83.1826.001).

레몬 그라스 ( Cymbopogon citratus )는 Premier Herbal Inc.에서 구입했습니다. 레몬 그라스는 커피 그라인더를 사용하여 미세 분말로 분쇄되었습니다. 분말을 100 % 무수 에탄올 (잎 분말 1g 내지 무수 에탄올 10mL)에서 밤새 실온에서 추출 하였다. 추출액을 0.45로 진공 여과에 이어 P8 굵은 필터 중력 여과를 통해 여과시키고  μ의 m 필터. 추출물을 40 ° C에서 로토 바프를 사용하여 증발시키고 에탄올에서 재구성하여 200 mg / ml의 최종 스톡 농도를 얻었다. 에탄올 성 추출물은 다음 Acrodisc® 0.2 통과시켰다 μ의 생물 안전성 캐비닛 m의 DMSO 안전 주사기 필터.

2.2. 세포 배양

전립선 암 세포주 DU-145 (ATCC® HTB-81 ™)는 10 % (v / v) 우 태아 혈청 (FBS, Catalog)이 보충 된 Eagle 's Minimum Essential Medium (EMEM) (ATCC® 30-2003 ™)에서 배양되었습니다. No. 12484-020, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) 및 0.4 % (v / v) gentamicin (카탈로그 번호 15710-064, Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, CA).

전립선 암 세포주 PC-3 (ATCC® CRL-1435 ™)는 10 % (v / v)가 보충 된 F-12K 배지 (Kaighn 's Modification of Ham 's F-12 Medium) (ATCC® 30-2004 ™)에서 배양되었습니다. 태아 소 혈청 (FBS) 및 0.4 % (v / v) 젠타 마이신.

정상 결장 점막 세포주 (ATCC® CRL-1831 ™)는 10 % (v / v) 소 태아 혈청 (FBS) 및 0.4 %가 보충 된 덜 베코의 수정 된 이글 배지 (DMEM) (ATCC® 30-2002 ™)에서 배양되었습니다. (v / v) 젠타 마이신.

모든 세포는 37 ℃ 배양기에서 유지 하였다 ° C를 5 % CO와 함께 2 와 95 %의 습도. 모든 세포는 6 개월 미만 동안 계대되었습니다.

2.3. Trypan Blue 배제 분석

동일한 양의 세포를 6- 웰 투명한 바닥 조직 배양 플레이트에 접종하고 다양한 농도의 수성 DRE, 에탄올 LGE 및 화학 요법 제로 처리했습니다. 처리 후 48 시간 및 96 시간에 세포를 수집하고 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척했습니다. 세포를 재현 탁 하였다 100  μ의 PBS의 L와 동량 (100 μ 트리 판 블루 용액 L) (제 T8154, 알드리치, 미시, ON, CA 카탈로그). Countess® II FL 자동 세포 계수기 (Life Technologies, Burlington, ON, CA)를 사용하여 생존 세포를 계수했습니다. GraphPad Prism 6 소프트웨어를 사용하여 결과를 분석하고 "생존 세포 수 / mL"로 표현하고 처리 기간 동안 생존 세포 수의 성장 곡선을 통해 표현했습니다.

2.4. 세포 사멸 분석 : Annexin V (AV) 결합 분석 및 Propidium Iodide (PI)

Annexin V 결합 분석 및 propidium iodide 염색을 각각 수행하여 괴사 또는 후기 세포 사멸의 마커 인 조기 세포 사멸 및 세포 투과성을 모니터링했습니다. 이 분석은 표준화되어 있으며 이전 연구에서이 분석을 사용하여 다양한 암세포에 대한 NHP의 효과를 분석했습니다 [ 15 , 24 ]. 세포를 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고 Annexin V 결합 완충액 (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl 2, pH 7.4) 녹색 형광 Annexin V Alexa Fluor 488 (1:20) (Life Technologies Inc., Cat. No. A13201, Burlington, ON, Canada) 및 0.01 mg / mL의 적색 형광 PI (Life Technologies Inc., Cat. No. P3566, Burlington, ON, Canada) 빛으로부터 보호 된 37 ° C에서 15 분 동안. 초기 (녹색) 및 후기 세포 사멸 세포 (녹색 및 적색) 및 괴사 세포 (적색)의 백분율을 Tali Image-Based Cytometer (Life Technologies Inc., Cat. No. T10796, Burlington, ON, Canada)로 정량화했습니다. 녹색 (예 : 458 nm; em. 525/20 nm) 및 빨간색 (예 : 530 nm; em. 585 nm) 채널을 모두 사용하여 18 개 이상의 무작위 필드에서 세포를 분석했습니다. 형광 현미경 사진은 Leica DMI6000 형광 현미경 (독일 Wetzlar)과 함께 LAS AF6000 소프트웨어를 사용하여 400 배 배율로 촬영되었습니다.μ 15 분 배양 동안 M.

2.5. 반응성 산소 종 (ROS) 청소

산화 스트레스에 대한 아폽토시스 유도의 의존성을 평가하기 위해 ROS 스 캐빈 저 N- 아세틸 시스테인 (NAC)을 사용하여 세포를 구출했습니다. 이 분석은 표준화되어 있으며 이전 연구에서이 분석을 사용하여 다양한 암세포에 대한 NHP의 효과를 분석했습니다 [ 15 , 24 ]. 세포를 10로 전처리 된  μ L NAC (알드리치 캐나다, 고양이. 제 A7250, 미시, ON, 캐나다) 37 ° C에서 30 분간 5 % CO에서 2. 그런 다음 세포를 표시된 기간 동안 처리하고, 수집하고, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, 녹색 형광 Annexin V Alexa Fluor 488 (1:20) 및 0.01 mg / mL의 적색 형광 PI를 사용하여 Annexin V 결합 완충액에 현탁했습니다. 빛으로부터 보호되는 37 ° C에서 15 분. 초기 (녹색) 및 후기 세포 사멸 세포 (녹색 및 적색) 및 괴사 세포 (적색)의 백분율을 Tali Image-Based Cytometer로 정량화했습니다. 녹색 (예 : 458 nm; em. 525/20 nm) 및 빨간색 (예 : 530 nm; em. 585 nm) 채널을 모두 사용하여 18 개 이상의 무작위 필드에서 세포를 분석했습니다.

2.6. Caspase 억제

세포 사멸 유도의 카스파 제 의존성을 평가하기 위해 카스파 제 억제제 Z-VAD-FMK를 사용하여 세포를 구출 하였다. 이 분석은 표준화되어 있으며 이전 연구에서이 분석을 사용하여 다양한 암 세포에 대한 NHP의 영향을 분석했습니다 [ 15 , 24 ]. 세포에 전처리 4  μ L-Z-VAD FMK (알드리치 캐나다, 고양이. 번호 V116, 미시, ON, 캐나다) 37에서 30 분간 ° C에서 5 % CO 2. 그런 다음 세포를 표시된 기간 동안 처리하고, 수집하고, 인산염 완충 식염수 (PBS)로 세척하고, 녹색 형광 Annexin V Alexa Fluor 488 (1:20) 및 0.01 mg / mL의 적색 형광 PI를 사용하여 Annexin V 결합 완충액에 현탁했습니다. 빛으로부터 보호되는 37 ° C에서 15 분. 초기 (녹색) 및 후기 세포 사멸 세포 (녹색 및 적색) 및 괴사 세포 (적색)의 백분율을 Tali Image-Based Cytometer로 정량화했습니다. 녹색 (예 : 458 nm; em. 525/20 nm) 및 빨간색 (예 : 530 nm; em. 585 nm) 채널을 모두 사용하여 18 개 이상의 무작위 필드에서 세포를 분석했습니다.

2.7. 민들레 뿌리 및 레몬 그라스 추출물 효능의 생체 내 평가

생후 6 주령의 면역 저하 CD1 nu / nu 마우스는 Charles River Laboratories에서 입수했습니다. 마우스를 수용하고 12 시간 동안 밝고 어두운 실험실 환경에서 캐나다 동물 관리위원회에 따라 윈저 대학교 동물 관리위원회 (AUPP # 17-15)에 의해 승인 된 관련 지침 및 규정을 사용하여 프로토콜을 따랐습니다. 사이클. 순응 기간 후, 마우스에게 전립선 암 세포 (DU-145, PC-3)를 피하 주사 하였다; 세포는 1.0x10 6 농도의 Matrigel®에 현탁되었습니다.뒷 옆구리에서 마우스 당 세포. 종양이 형성되면 마우스를 무작위로 세 그룹 (대조군, DRE 음용수 및 LG 음용수)으로 분리했습니다. 대조군과 화학 요법 마우스는 정상적인 물을, DRE 처리 군은 40mg / kg / 일을, LGE 처리 군은 16mg / kg / 일을 8 주 동안 받았다. 그런 다음 CO 2 챔버를 사용하여 마우스를 희생 시키고 자궁 경부 탈구를 수행하고 종양을 수확했습니다. 종양 부피 ( 대략적인 부피를 계산하기 위해 공식 1/2 (L W 2 ) 사용) 및 각 마우스의 체중을 연구 기간 동안 격일로 측정했습니다.

2.8. 통계 분석

모든 통계 분석은 GraphPad 6.0 Prism 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다. 통계적 유의성을 테스트하기 위해 ANOVA (Two-Way Analysis of Variance)를 사용했습니다. 모든 시험은 최소 3 회 독립적으로 수행되었습니다.

3. 결과 텍스트3.1. 민들레 뿌리와 ​​레몬 그라스 추출물은 전립선 암 세포에서 용량 및 시간 의존 방식으로 세포 자멸사를 유도합니다

민들레 뿌리의 뜨거운 물 추출물과 레몬 그라스의 에탄올 추출물은 재료 및 방법에 설명 된대로 준비되었습니다. DRE와 LGE의 항암 효능을 조사하기 위해, 전립선 암 세포를 Trypan Blue 염료를 사용하여 염색하여 48 시간 및 96 시간 처리 후 이미지 기반 세포 측정법을 통해 세포 투과성을 평가했습니다. 전립선 암 세포 (DU-145, PC-3)를 추가로 아폽토시스 마커 인 Annexin V (AV) 및 프로피 듐 요오드화물 (PI)로 형광 염색했습니다. 그런 다음 세포를 48 시간 및 96 시간 처리 후 형광 이미지 기반 세포 측정을 수행했습니다.

LGE는 Trypan Exclusion assay를 통해 세포 사멸을 유도하는 데 효과적인 것으로 관찰되었으며 DRE는 96 시간 치료에서만 효능을 나타 냈습니다 (그림 1 (a) ). 이러한 관찰은 LGE와 DRE가 각각 치료 후 48 시간과 96 시간에 아폽토시스를 유도하는 데 효과적임을 나타내는 형광 이미지 세포 측정 결과에 의해 확증되었습니다 (그림 1 (b)).). 구체적으로, 두 시점 모두에서 0.05 mg / mL (DMSO 1mL 중 조 추출물 0.05mg)의 투여 량에서 시작하여 LGE에 대한 두 전립선 암 세포주에서 유의 한 세포 사멸이 관찰되었습니다. DRE의 경우, 4 mg / mL 처리에서 시작하여 유의 한 세포 사멸 유도가 관찰되었습니다. 증가 된 처리 농도 및 처리 시간이 아폽토시스 유도를 증가함에 따라 투여 량 및 시간 의존적 아폽토시스 유도가 두 세포주에서 추가로 관찰되었다.

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그림 1

민들레 뿌리와 ​​레몬 그라스 추출물은 전립선 암 세포에서 세포 사멸을 유도합니다. (a) 전립선 세포주 DU-145를 DRE, LGE, 화학 요법 탁솔 및 미 톡산 트론의 다양한 처리로 처리하고 48 시간 및 96 시간에 평가했습니다. 비히클 대조군과 비교하여 살아있는 세포의 백분율을 평가하기 위해 이미지 기반 세포 측정법을 사용하여 결과를 얻었습니다. (b) 전립선 세포주 DU-145 (상단 패널) 및 PC-3 (하단 패널)을 DRE, LGE 및 화학 요법의 다양한 처리로 처리하고 48 시간 및 96 시간에 평가했습니다. Annexin V (녹색), 프로피 듐 요오드화물 (PI, 빨간색), 둘 다 (노란색) 또는 Annexin V 및 PI 모두에 대해 음성 (파란색)과 관련된 형광 양성 세포의 백분율을 평가하기 위해 이미지 기반 세포 측정법을 사용하여 결과를 얻었습니다. 값은 세 개의 독립적 인 실험에서 평균 ± SD로 표현됩니다. 통계 계산은 양방향 ANOVA 다중 비교를 사용하여 수행되었습니다.p <0.05 대 대조군, p <0.01 대 대조군, p <0.0001 대 대조군.

두 전립선 암 세포주는 탁솔의 표준 화학 요법 치료와 DRE / LGE 치료 사이의 아폽토시스 유도를 비교하기 위해 탁솔로 추가로 처리되었습니다. 두 세포주에서 DRE 및 LGE 처리는 탁솔 처리와 비교할 때 유사하거나 강화 된 세포 사멸 유도를 초래했습니다 (그림 1 (b) ).

3.2. 민들레 뿌리 추출물과 레몬 그라스 추출물은 전립선 암 세포에 선택적입니다

DRE와 LGE 치료가 전립선 암에 선택적이라면 약물 관련 부작용의 위험을 최소화 할 수 있습니다. DRE와 LGE가 정상적인 건강한 비 암성 세포에 영향을 미치는지 여부를 평가하기 위해 정상 결장 점막 (NCM) 세포를 DRE 및 LGE로 처리하고 위에서 설명한대로 형광 이미지 기반 세포 측정법을 사용하여 평가했습니다. 처리되지 않은 대조군과 비교하여 DRE 및 LGE 처리는 세포 사멸 유도에서 유의 한 증가를 보이지 않았습니다 (그림 2 ). 이 실험에서 사용 된 최고 용량 (4mg / mL DRE, 0.05mg / mL LGE)은 전립선 암 세포를 치료하는 데 사용될 때 유의 한 세포 사멸을 유도 할 수 있었지만 NCM 세포는 그렇지 않았습니다. 또한, DRE 및 LGE 처리는 정상적인 건강한 세포에 영향을 미치지 않는 반면, 탁솔은 전립선 암 세포에서와 유사한 방식으로 이들 세포에서 세포 사멸을 유도했습니다.

그림 2

민들레 뿌리와 ​​레몬 그라스 추출물은 암에 선택적이고 화학 요법 제의 독성을 감소시킵니다 . 정상 결장 점막 (NCM) 세포를 다양한 용량의 DRE, LGE 및 DRE 또는 LGE 조합 처리를 탁솔로 처리하고 48 시간에 평가했습니다. Annexin V (녹색), 프로피 듐 요오드화물 (PI, 빨간색), 둘 다 (노란색) 또는 Annexin V 및 PI 모두에 대해 음성 (파란색)과 관련된 형광 양성 세포의 백분율을 평가하기 위해 이미지 기반 세포 측정법을 사용하여 결과를 얻었습니다. 값은 세 가지 독립적 인 실험에서 평균 ± SD로 표현됩니다. 통계 계산은 양방향 ANOVA 다중 비교를 사용하여 수행되었습니다. p <0.05 대 대조군, p <0.01 대 대조군, p<0.0001 대 대조군, @p <0.05 대 개별 화학 요법 치료.

DRE와 LGE의 조합 치료의 이점을 추가로 조사하기 위해 NCM 세포에 대한 화학 요법 치료에 DRE 또는 LGE 추가의 효과를 조사했습니다. 보호한다면 DRE 또는 LGE는 탁솔에 의한 정상적인 건강한 세포에서 세포 사멸 유도의 양을 최소화 할 수 있습니다. 실제로, 우리는 표준 탁솔 화학 요법 치료에 DRE와 LGE를 추가하면 탁솔 치료 단독 치료와 비교할 때 세포 자멸사 유도가 감소한다는 것을 관찰했습니다 (그림 2 ). 이러한 결과는 DRE와 LGE가 전립선 암에 선택적이고 정상적인 건강한 세포가 화학 요법의 표적이되는 것을 잠재적으로 보호 할 수 있음을 나타냅니다.

3.3. 민들레 뿌리 및 레몬 그라스 추출물과 표준 Chemotherapies Taxol 및 Mitoxantrone의 상호 작용

오늘날 표준 치료에서는 많은 화학 요법이 다른 약물과 함께 사용됩니다. 새로운 치료 요법에서 보조제 또는 병용 요법에 사용되는 DRE 및 LGE의 잠재력을 적절하게 평가하기 위해 DRE 또는 LGE와 탁솔 및 미 톡산 트론 간의 상호 작용을 결정하기 위해 병용 치료 분석을 수행했습니다. 이러한 NHP는 화학 요법 효능을 향상 시키거나 억제하거나 영향을 미치지 않을 수 있습니다. DU-145 전립선 암 세포는 4mg / mL DRE (그림 3 ) 또는 0.01mg / mL LGE (그림 4 ) 의 존재 또는 부재하에 탁솔 또는 미 톡산 트론으로 처리되었습니다 . 재료 및 방법에 설명 된대로 이미지 기반 세포 측정법과 형광 현미경 검사법을 사용하여 전립선 암 세포에서 세포 자멸사를 유도하는 이러한 치료의 능력을 분석했습니다.

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그림 3

민들레 뿌리 추출물과의 병용 치료로 전립선 암 세포의 항암제 효능 향상. (a) DU-145 세포를 화학 요법 탁솔 (상단 패널) 및 미 톡산 트론 (하단 패널)으로 개별적으로 처리하고 4mg / mL DRE와 조합하여 48 시간에 평가했습니다. Annexin V (녹색), 프로피 듐 요오드화물 (PI, 빨간색), 둘 다 (노란색) 또는 Annexin V 및 PI 모두에 대해 음성 (파란색)과 관련된 형광 양성 세포의 백분율을 평가하기 위해 이미지 기반 세포 측정법을 사용하여 결과를 얻었습니다. 값은 세 개의 독립적 인 실험에서 평균 ± SD로 표시됩니다. 생존 세포의 백분율은 개별 화학 요법 및 조합 화학 요법 처리 모두에 대해 그래프로 표시되었습니다 (오른쪽 그래프). (b) 개별 및 히비스커스 조합 화학 요법 치료의 형광 현미경 이미지. 상단 패널 : 명 시야 및 형광 병합 이미지 (400x 배율). 바닥: Annexin V (녹색), PI (빨간색) 및 Hoechst (파란색)로 400 배 배율로 염색 된 형광 이미지. 스케일 바는 50 미크론입니다. 이미지는 세 가지 독립적 인 실험을 나타냅니다. 통계 계산은 양방향 ANOVA 다중 비교를 사용하여 수행되었습니다.p <0.05 대 대조군, p <0.01 대 대조군, p <0.0001 대 대조군, @p <0.05 대 개별 화학 요법 치료.

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그림 4

레몬 그라스 추출물과의 병용 치료로 전립선 암 세포의 항암제 효능 향상. (a) DU-145 세포를 화학 요법 탁솔 (상단 패널) 및 미 톡산 트론 (하단 패널)을 0.01mg / mL LGE와 조합하여 개별적으로 처리하고 48 시간에 평가했습니다. Annexin V (녹색), 프로피 듐 요오드화물 (PI, 빨간색), 둘 다 (노란색) 또는 Annexin V 및 PI 모두에 대해 음성 (파란색)과 관련된 형광 양성 세포의 백분율을 평가하기 위해 이미지 기반 세포 측정법을 사용하여 결과를 얻었습니다. 값은 세 개의 독립적 인 실험에서 평균 ± SD로 표시됩니다. 생존 세포의 백분율은 개별 화학 요법 및 조합 화학 요법 처리 모두에 대해 그래프로 표시되었습니다 (오른쪽 그래프). (b) 개별 및 히비스커스 조합 화학 요법 치료의 형광 현미경 이미지. 상단 패널 : 명 시야 및 형광 병합 이미지 (400x 배율). 바닥: Annexin V (녹색), PI (빨간색) 및 Hoechst (파란색)로 400 배 배율로 염색 된 형광 이미지. 스케일 바는 50 미크론입니다. 이미지는 세 가지 독립적 인 실험을 나타냅니다. 통계 계산은 양방향 ANOVA 다중 비교를 사용하여 수행되었습니다.p <0.05 대 대조군, p <0.01 대 대조군, p <0.0001 대 대조군, @p <0.05 대 개별 화학 요법 치료.

미 톡산 트론 치료에 4mg / mL DRE를 첨가하면 미 톡산 트론 치료 단독 치료에 비해 세포 자멸사 유도를 크게 증가시킬 수있었습니다 (그림 3 (a) ). 그러나 DRE는 탁솔과 상호 작용이없는 것으로 보이며 그 작용을 억제하지도 않았습니다. 탁솔 및 미 톡산 트론 치료 모두에 0.01 mg / mL LGE를 첨가하면 개별 치료에 비해 세포 사멸 유도를 크게 증가시킬 수있었습니다 (그림 4 (a) ). 흥미롭게도, (0.01 탁솔 치료의 조합 낮은 투여 μ 0.01 ㎎ / ㎖와 LGE M)는 택솔의 최대 개별 치료 투여 (0.5 아폽토시스 유도를 비교 하였다 μ미디엄). 이는 LGE 병용 치료가 화학 요법 농도를 50 배 감소시키면서 개별 치료와 유사한 세포 사멸 유도를 나타낼 수 있음을 나타냅니다.

세포 형태에 대한 처리의 효과를 평가하기 위해 형태 학적 분석을 수행 하였다. 조합 DRE 처리 (그림 3 (b) ) 및 조합 LGE 처리 (그림 4 (b) ) 후 Annexin V 및 요오드화 프로피 듐 염색 후 형광 현미경 으로 위에서 설명한 바와 같이 아폽토시스 유도를 확인했습니다. 이러한 세포 사멸 마커는 예상대로 처리 된 전립선 암 세포에서 관찰되었으며, 세포 수축, 막 출혈 및 핵 응축을 포함한 세포 사멸 형태도 함께 관찰되었습니다.

3.4. 민들레 뿌리 추출물에 의한 아폽토시스는 카스파 아제에 의존하는 반면 레몬 그라스 추출물에 의한 아폽토시스는 산화 스트레스에 의존합니다

DRE와 LGE는 복잡한 방식으로 상호 작용하고 기능 할 수있는 다양한 화합물로 구성된 추출물입니다. 이러한 복합 추출물이 어떻게 항암 효과를 나타내는 지 이해하기 위해서는 세포 사멸 유도 메커니즘을 조사해야합니다. 산화 스트레스를 통해 아폽토시스가 유도되는지 확인하기 위해 N- 아세틸 시스테인 (NAC)이 사용됩니다. NAC는 활성 산소 종 (ROS) 스 캐빈 저이므로 유도가 주로 산화 스트레스로 인한 경우 세포 사멸로부터 세포를 구할 수 있습니다. NAC와 함께 전립선 암 세포에 대한 LGE 처리는 개별 LGE 처리와 비교할 때 세포 자멸 유도의 양을 현저하게 줄일 수 있었지만 DRE 처리는 영향을받지 않은 것처럼 보입니다 (그림 5 ).

그림 5

민들레 뿌리 추출물 apoptosis 유도는 caspase 의존적이며 lemongrass 추출물 apoptotic 유도는 산화 스트레스 의존적 입니다. DU-145 세포를 N- 아세틸 시스테인 (NAC, 활성 산소 종 제거제) 또는 Z-VAD-FMK (카스파 제 억제제)로 전처리하고 다양한 용량의 DRE, LGE 및 DRE 또는 LGE 조합 처리를 탁솔로 처리하고 평가했습니다. 48 시간과 96 시간에. Annexin V (녹색), 프로피 듐 요오드화물 (PI, 빨간색), 둘 다 (노란색) 또는 Annexin V 및 PI 모두에 대해 음성 (파란색)과 관련된 형광 양성 세포의 백분율을 평가하기 위해 이미지 기반 세포 측정법을 사용하여 결과를 얻었습니다. 값은 세 가지 독립적 인 실험에서 평균 ± SD로 표현됩니다. 통계 계산은 양방향 ANOVA 다중 비교를 사용하여 수행되었습니다. p <0.05 대 대조군,p <0.01 대 대조군, p <0.0001 대 대조군, #p <0.05 대 개별 DRE 처리, @p <0.05 대 개별 LGE 처리.

또한, 아폽토시스 유도가 카스파 제 의존성인지 독립적인지 확인하기 위해 일반적으로 사용되는 광범위한 카스파 제 억제제 인 Z-VAD-FMK가 사용됩니다. 의존하는 경우 Z-VAD-FMK는 세포를 구출하고 위에서 설명한대로 의존성을 나타낼 수 있습니다. 실제로, DRE 치료는 DRE 및 Z-VAD-FMK로 치료할 때 구조되었으며, 개별 DRE 치료와 비교할 때 세포 자멸 유도가 현저하게 감소했습니다 (그림 5 ). LGE 처리는 카스파 제 억제에 반응하지 않았습니다.

3.5. 민들레 뿌리와 ​​레몬 그라스 추출물의 경구 투여는 면역 저하 마우스의 전립선 암 이종 이식 모델에서 종양 부담을 감소시킵니다

DRE와 LGE의 항암 효능을 확인하고 추가로 지원하기 위해, 우리는 이러한 추출물이 면역 손상 마우스에서 이종 이식 된 전립선 암 세포의 성장을 억제하는 능력이 있는지 조사하고자했습니다. DU-145 및 PC-3 세포를 마우스에 피하 이식했습니다. 종양 형성 후, 치료 그룹은 8 주 동안 DRE 또는 LGE 보충 식수를 경구 투여했습니다. 실제로, DRE와 LGE는 비히클 대조군과 비교하여 종양 부피 및 무게에 의해 결정된 바와 같이 이종 이식 된 마우스의 종양 부담을 줄일 수 있었다 (도 6 (a) 및 6 (b) ). 치료 과정에서 대조군과 비교했을 때 각 치료군에서 마우스 체중 증가에 명백한 변화가 없었으며, 이는 이러한 치료가 잘 견디 었음을 나타냅니다 (그림6 (c) ). 따라서 DRE와 LGE는 경구 투여시 종양 부담과 생체 내 성장 을 줄이는 데 효과적이며 잘 견뎌냈습니다.

(ㅏ)

(비)

(씨)

(ㅏ)

(비)

(씨)

그림 6

민들레 뿌리와 ​​레몬 그라스 추출물을 경구 투여하면 전립선 암 이종 이식 생쥐의 종양 부담이 줄어 듭니다 . DU-145 (a) 및 PC-3 (b) 전립선 암 세포를 면역 손상 마우스 뒷쪽 옆구리에 피하로 이종 이식시켰다. 종양 형성 후, 이들 마우스는 8 주 동안 민들레 뿌리 (DRE)와 레몬 그라스 (LGE) 추출물을 경구로 먹였다. 마우스를 희생시킨 후, 종양 (상단 패널)을 절제하고 종양 부피 ( 대략 부피를 계산하기 위해 공식 1/2 (L W 2 )를 사용하여) 및 종양 중량에 대해 측정했습니다. (c) 마우스 체질량은 일주일에 두 번 측정되었으며 대조군, DRE 및 LGE 그룹을 비교하기 위해 평균화되었습니다. 일원 분산 분석 다중 비교를 사용하여 통계 계산을 수행했습니다. p <0.05 대 대조군,p <0.01 대 대조군, p <0.0001 대 대조군. 표시는 중요하지 않음과 통제를 나타냅니다.

4. 토론

우리는이 보고서에서 DRE와 LGE가 시간과 용량 의존적 방식으로 전립선 암 세포에서 세포 사멸을 유도한다는 것을 입증했습니다 (그림 1 ). 탁솔과 같은 화학 요법과 달리, 이들 추출물에 의한 세포 사멸 유도는 정상 결장 점막 (NCM)에 큰 영향을주지 않고 전립선 암 세포에 대해 매우 선택적입니다 (그림 2 ). 중요한 것은 DRE 및 LGE를 탁솔 또는 미 톡산 트론과 함께 사용하는 보조제 치료가 이러한 약물의 세포 사멸 유도 능력을 향상 시켰음을 보여주었습니다 (그림 3 및 4 ). 또한 생체 내 DRE와 LGE의 항암 효능을 평가했습니다.우리는 이러한 추출물이 인간 전립선 암 이종 이식을 가진 생쥐의 종양 부담을 현저하고 획기적으로 줄일 수 있음을 보여주었습니다. 이들 추출물은 경구 투여되었고, 내약성이 우수했으며, 마우스 식욕이나 체중에 영향을 미치지 않았습니다. 이러한 결과는 관찰 된 활성 향상으로 인해 화학 요법 요법에서 DRE 및 LGE 보충의 잠재력을 뒷받침합니다.

DRE에 대한 이전 연구는 백혈병 및 결장암 세포에서 세포 사멸을 유도하는 데 효능이 있음을 보여주었습니다 [ 14 , 17]. 그러나 DRE와 LGE가 인간 전립선 암 세포에 미치는 영향은 아직 연구되지 않았습니다. 실제로 DRE와 LGE는 두 전립선 암 세포주에서 시간 및 용량 의존적으로 세포 자멸사를 유도했습니다. 이들 세포는 Annexin V 결합을 포함한 세포 자멸사의 특징적인 특징을 나타냈다. 이 추출물은 물 또는 에탄올을 사용하여 제조되었습니다. 둘 다 생체 적합성 용매이므로 식품 보충제의 범주에 속합니다. 그들은 전통적으로 차 또는 약용 식품으로 소비되어 왔으며 잘 견디는 것으로 나타났습니다. DRE와 LGE의 복용량은 치료제에 사용되는 순수 복합 치료법에 비해 더 높지만, 이들은 민들레 뿌리와 ​​레몬 그라스의 조 추출물이라는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 이 추출물은 항암 활동을 담당하는 생리 활성 식물 화학 물질 외에도 많은 일반적인 화합물 (소금 및 설탕)을 포함 할 수 있습니다. 우리는 이전에 민들레 뿌리, 레몬 그라스, 장 고추 추출물의 식물 화학적 분석을 통해 보여주었습니다.Piper longum ) 활성 화합물 농도가 매우 낮다는 것을 알 수 있습니다 [ 14 – 16 ]. 또한, DRE와 장 고추 추출물의 활성 성분은 단독으로 사용할 경우 세포 자멸사를 유도하는 데 효과가 없음을 보여주었습니다 [ 16 ] 이는 이러한 추출물이 함께 작용하고 여러 경로를 표적으로하는 여러 화합물을 통해 효과적 일 수 있음을 나타냅니다.

일반적으로 종양 전문의는 화학 요법과 함께 자연 건강 제품 (NHP)의 사용에 대해주의를 기울입니다. 이는 주로 NHP가 화학 요법 치료와 부정적으로 상호 작용하여 이러한 약물의 효능을 감소시킬 수있는 잠재력 때문입니다. 따라서 이러한 추출물과 표준 화학 요법의 상호 작용을 조사하는 것이 매우 중요합니다. 우리는 DRE, LGE 및 일반적인 화학 요법 간의 이러한 상호 작용을 조사했습니다. 실제로, 우리는 4mg / mL DRE를 첨가하면 미 톡산 트론의 효능이 향상되는 반면 탁솔에는 큰 영향을 미치지 않음을 입증했습니다 (그림 3 ). 또한 0.01 mg / mL LGE를 추가하면 탁솔 및 미 톡산 트론 치료의 효능을 향상시킬 수있었습니다 (그림 4). 이러한 결과는 이러한 NHP가 화학 요법 제와 갖는 상호 작용이 양성이며 화학 요법의 효과를 향상 시킨다는 것을 분명히 나타냅니다. 가장 흥미롭게도, 1 nM 미 톡산 트론 치료에 DRE를 추가하면 20 nM 미 톡산 트론 단독 농도에서 유사한 세포 사멸 유도가 나타납니다. 마찬가지로, 0.01 LGE 첨가 μ M의 탁솔은 0.5와 동일한 효과를 가져 μM 탁솔. 이러한 결과는 DRE 및 LGE를 사용한 보조 요법이 잠재적으로 필요한 농도를 감소시켜 약물 관련 부작용을 피할 수 있음을 나타냅니다. 따라서, 우리는 이러한 NHP가 화학 요법의 보조제로 사용될 수 있고 잠재적으로 그 효과를 향상시킬 수 있음을 처음으로 보여주었습니다. 천연 추출물은 어떤 경우에는 삶의 질을 향상시키기 위해 화학 요법 환자에게 사용되었습니다 [ 25 ].

전립선 암에서 이들 추출물에 의한 세포 사멸 유도 메커니즘은 세포 사멸의 근본 원인을 결정하는 데 큰 관심을 끄는 주제입니다. 우리는 이전에 DRE와 LGE가 산화 스트레스를 유도하고 미토콘드리아 막 잠재력을 감소시켜 암세포에서 세포 사멸을 유도 할 수 있음을 입증했습니다 [ 14 , 15 ]. 정확한 메커니즘이 완전히 밝혀지지는 않았지만, 높은 활성 산소 종 (ROS) 수준이 세포 스트레스 메커니즘을 활성화 할 수 있고 암세포를 추가 ROS 생성에 민감하게하여 아폽토시스를 유발할 수 있다는 가설이 세워졌습니다 [ 7 ]. 산화 스트레스를 통해 세포 자멸사 유도를 억제함으로써 N 아세틸 시스테인 (NAC), 공지 ROS 제거제이다 수 복구 세포 [ 26]. 또한, 우리는 유사한 방식으로 caspase 작용에 대한 세포 사멸 유도의 의존성을 평가하기 위해 caspase 억제제 Z-VAD-FMK를 사용할 수 있습니다. 이 분석은 우리의 치료가 아폽토시스를 유도하기 위해 ROS 의존적인지 카스파 제 의존적인지 여부를 평가할 수있게합니다. 실제로 NAC와 함께 LGE 처리가 DU-145 세포를 구출 할 수 있음을 관찰했습니다 (그림 5) Z-VAD-FMK를 사용한 LGE 처리는 세포 사멸을 억제하지 않았는데, 이는 LGE 처리가 ROS 의존적이고 카스파 제 독립적임을 나타냅니다. 흥미롭게도, DRE 처리는 NAC에 의한 어떠한 억제도 나타내지 않았지만 Z-VAD-FMK에 의해 억제되어 DRE 처리가 카스파 제 의존적이고 ROS 독립적임을 나타냅니다. 이러한 처리는 약간의 감소를 보였지만 완전히 구제 된 세포는 없었으며, 이는 이러한 추출물의 작용 메커니즘이 다각적 일 수 있으며 추가 조사가 필요함을 나타냅니다. 추가 연구는 2 ', 7'-dichlorofluorescein diacetate (H 2 DCFDA) 처리 를 통해 생성되는 ROS의 양을 정량화 하거나 이러한 추출물을 추가로 평가하기 위해 다양한 작용 메커니즘을 평가하는 것을 조사 할 수 있습니다.

앞서 지적한 바와 같이 탁솔과 미 톡산 트론은 비 선택적 표적화로 인해 부주의 한 부작용을 나타냈다 [ 9 , 10 , 27 ]. 실제로, 우리는 탁솔이 정상 결장 점막 (NCM) 세포에 독성이 있음을 관찰했습니다 (그림 2 ). 우리는이 연구에서 LGE 및 DRE 치료가 정상적인 비 암성 세포에 영향을주지 않고 전립선 암 세포에 선택적으로 독성이 있음을 보여주었습니다 (그림 2). 흥미롭게도, 탁솔에 DRE 또는 LGE를 추가하면 탁솔 단독 처리에 비해 정상적인 건강한 세포에서 세포 사멸의 정도를 현저하게 줄일 수있었습니다. 이러한 보호 효과는 종종 화학 요법과 관련된 약물 관련 독성을 줄이기 위해 장기 보조 요법에서 DRE 및 LGE를 사용할 가능성을 나타냅니다.

일부 천연 추출물은 전립선 암에 대한 항암 효능이있는 것으로 나타 났지만 이러한 연구는 시험관 내 작업 으로 제한되었습니다 [ 28 – 30 ]. 인간 전립선 암 이종 이식이 있는 생체 내 마우스 모델을 사용하여 전립선 암에 대한 천연 추출물의 효능을 평가하는 것은 매우 중요합니다 . 우리 는 생쥐 (인간 전립선 암 이종 이식)가 종양 형성 후 식수에 DRE와 LGE를 경구 투여 한 생체 내 연구를 수행했습니다 . 실제로 DRE와 LGE 모두 전립선 암 종양의 종양 부담을 크게 줄일 수있었습니다 (그림 6 (a) 및 6 (b)).) 마우스의 전체 체중 증가에 최소한의 영향을 미치면서 (그림 6 (c) ) 일반적인 내성을 나타냅니다. 이러한 결과는 이러한 추출물의 항암 생체 활성 화합물이 체계적인 소비시 흡수되고 안정되어야하며 결국 피하 부위의 종양 성장에 영향을 미쳤음을 나타냅니다. 이것은 정맥 또는 복강 내 투여와 같은 방법이 아닌 마우스 음용수를 통해 치료가 경구 투여된다는 점을 고려해야하기 때문에 중요합니다. 우리는 이미 DRE와 LGE가 마우스 모델에서 잘 견딘다는 것을 증명했습니다 [ 14 , 15]. 따라서, DRE 및 LGE 치료가 전립선 암에 대해 효과적이고 잘 견디기 때문에, 이러한 NHP는 관해 기간을 연장하는 장기 소비에 안전합니다.

5. 결론

이 연구에서 우리는 전립선 암 세포에서 선택적으로 세포 사멸을 유도하는 DRE와 LGE의 효능을 입증했습니다. 우리는 처음으로 DRE와 LGE와 taxol 및 mitoxantrone과 같은 표준 화학 요법 제가 세포 사멸을 유도하는 능력을 향상시키는 긍정적 인 상호 작용을 보여주었습니다. 가장 중요한 것은 DRE와 LGE를 추가하면 개별 치료 (고용량)와 비교하여 동일한 정도의 세포 사멸로 화학 요법의 용량이 감소했습니다. 따라서 DRE와 LGE는 치료에 필요한 용량을 줄임으로써 화학 요법 제로 약물 관련 독성을 줄일 수 있습니다. 또한, 인간 전립선 암 이종 이식을 가진 마우스에 DRE 및 LGE의 경구 투여는 종양 부담을 상당히 감소시킬 수 있었다. 이 추출물은 정상적인 체중 증가 및 음식 섭취로 표시된 것처럼이 마우스에서 잘 견디 었습니다. 그러므로, 이러한 결과는 DRE와 LGE가 잠재적으로 미 톡산 트론 및 탁솔과 함께 이들 약물의 효능을 향상시키고 전립선 암 환자의 독성 감소로 인해 삶의 질을 향상시키는 보조제로 사용될 수 있음을 시사합니다. 이러한 발견은 또한 전립선 암 치료를위한 유망한 항암 옵션으로서 이러한 NHP의 추가 개발을 지원합니다

[차동댁]

좋은 정보 감사합니다