재생의학에서 중간엽 줄기세포 유래 분비체의 치료 가능성

[개미선장1]

재생의학에서 중간엽 줄기세포 유래 분비체의 치료 가능성특별호 보기

연구논문 | 오픈 액세스

2020년 볼륨 | 문서 ID 1802976 | https://doi.org/10.1155/2020/1802976

인용 표시

인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포의 수용성 PTX3는 신생아 쥐 모델에서 대식세포 분극을 활성화하여 고산소성 폐 손상을 약화시킵니다.

김미연,1권지혜,1배윤경,1김지혜,1엄소연,1하주은,1최수진,1오원일,1그리고 혜진진1

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학술 편집자: Mustapha Najimi

받은2019년 07월 03일

개정2019년 11월 18일

허용2019년 11월 27일

게시2020년 1월 23일

추상적인

중간엽줄기세포(MSC)를 이용한 다양한 염증 관련 질환의 치료는 최근 몇 년 동안 이들 세포의 파라크린 작용으로 인해 증가하고 있지만 몇 가지 한계가 있습니다. 첫째, MSC 기반 치료법은 다양한 효능을 나타냅니다. 따라서 바이오마커는 이러한 후보 치료제로부터 누가 혜택을 받을 수 있는지 식별하기 위해 결정되어야 합니다. 둘째, 치료 효과의 기저에 있는 메커니즘이 잘 이해되지 않고 있다. 대식세포에 대한 인간 제대혈 유래 MSC(UCB-MSC)의 효과를 평가하기 위해 지질다당류(LPS)로 자극된 대식세포 세포주 NR8383을 UCB-MSC에 의해 공동 배양했습니다. 우리는 UCB-MSC가 M1 대식세포에서 M2로 향하는 대식세포 분극의 변화를 매개한다는 것을 발견했습니다. UCB-MSC의 항염증 효과의 기저에 있는 파라크린 작용을 확인하기 위해 LPS 자극 NR8383 세포에 노출된 UCB-MSC의 분비를 비오틴 라벨 기반 507 항체 어레이를 사용하여 테스트했습니다. 분비된 단백질 중 펜트락신 관련 단백질 PTX3/종양괴사인자 유도 유전자 14 단백질(PTX3)을 선정하여 대식세포 분극에서 UCB-MSC와의 연관성을 조사하였습니다. 염증 조건에서 UCB-MSC에서 인간 PTX3가 분비되고 NR8383 세포에서 MSK1/2 인산화 신호전달을 활성화하여 Dectin-1 수용체를 통해 M2 대식세포 마커를 강화하는 것을 확인했습니다. 이에 따라 UCB-MSC에서 PTX3의 녹다운은 신생아 고산소성 폐 손상에서 치료 효과를 현저히 약화시켜 대조군 MSC 주입 쥐에 비해 생존율, 폐포화, M2 마커 발현, Dectin-1 수치, 항염증성 사이토카인, M1 마커 발현 및 염증성 사이토카인 개선을 초래했습니다. UCB-MSC는 대식세포 분극을 조절하여 치료 가능성을 보여줍니다. 흥미롭게도, UCB-MSC에서 PTX3 수치가 높을수록 PTX3 수치가 낮을수록 치료 효과가 더 크게 개선되었습니다. 종합적으로, PTX3는 염증성 질환에서 MSC 요법의 치료 가능성을 예측하기 위한 중요한 파라크린 효과를 가진 잠재적 마커입니다. PTX3를 사용한 품질 관리 평가는 UCB-MSC의 치료 효과를 개선하는 데 유용할 수 있습니다.

1. 소개

중간엽 줄기세포(MSC)는 지속적인 자가 재생 능력과 특정 세포로의 분화 능력뿐만 아니라 손상된 조직을 재생하고 다양한 면역 세포 기능을 조절하는 능력을 나타냅니다[1–4]. 손상된 장기 또는 조직의 기능적 회복을 위해 다양한 질병을 치료하기 위한 MSC의 사용에 대한 연구가 활발히 진행되고 있습니다[5–7].

그러나 일부 연구에서는 손상된 조직에 MSC를 주입했을 때 예상보다 낮은 치료 효과가 보고되었습니다. 예를 들어, BM-MSC의 정맥 주사에 대한 임상 연구에서 중증 염증성 크론병 환자에서 제한된 임상적 효과만 관찰되었습니다[8]. 또한, 피부 결손 모델에서 MSC의 피하 주사는 상처 치유 효과로 이어지지 않았다[9]. 이러한 결과는 MSC의 이질성에 기인할 수 있습니다. (1) MSC는 생존 가능한 세포이기 때문에 일관된 효능을 나타내는 기존 약물과 달리 상황에 따라 효능이 달라질 것으로 예측됩니다. (2) 공여체 변이는 다양한 효과를 초래할 수 있습니다. 따라서 MSC의 임상 적용은 여전히 제한적입니다. 이러한 문제는 고효율 줄기세포를 선정하기 위한 기준을 결정함으로써 해결될 수 있습니다.

최근 연구에 따르면 다양한 질병에서 염증 조절 과정에서 MSC는 대식세포 분극을 유도할 수 있으며, 이를 통해 염증 억제 및 항염증 강화 등의 치료 효과가 관찰되었습니다[10–12]. M1 대식세포는 고전적으로 활성화된 대식세포입니다. 외부 자극은 인터루킨-(IL-) 1 α, IL-6, IL-8 및 종양괴사인자-α의 분비를 통해 염증 작용을 유발합니다. 대조적으로, M2 대식세포는 대안적으로 활성화되고 IL-4, IL-10, IL-13 및 아르기나제 1(Arg1)을 활성화하여 항염증 작용을 일으킵니다. 대표적인 표지자로서 CD11b, CD40 및 CD80은 M1 대식세포를 식별하는 데 사용되며, CD163 및 CD206은 M2 대식세포[13–15]. 이러한 대식세포 분극은 주요 전사 조절 인자, 및 신호 변환기와 전사 활성인자 간의 조절 상호작용, 인터페론 조절 인자, 핵 인자-(NF-)κB, 활성인자 단백질 1, 과산화소체 증식제-활성화 수용체-γ, cAMP 반응-결합 요소[13, 16, 17] 및 다른 것들은 다양한 염증성 질환에서 대식세포 분극을 조절합니다[18].

이 세포세포는 MSC가 병변이 있는 부위에 노출될 때 미세환경에 반응하여 다양한 치료용 단백질을 방출하는 것으로 나타났습니다. 따라서 MSC에 의해 분비되는 다양한 단백질은 병변 부위의 회복에 기능하며, 이를 파라크린 효과[19, 20]. 분비된 치료용 단백질은 혈관신생인자, 성장 및 영양인자, 케모카인, 항염증성 사이토카인 등의 역할을 하며 면역조절에 관여하는 것으로 알려져 있다[21]. 특히, 선행 연구에 따르면 염증성 질환에 노출된 MSC는 대식세포 분극에 관여하는 것으로 알려진 종양괴사인자 유도 유전자 6(TSG6) 또는 프로스타글란딘 E2(PGE2)를 분비한다.22–24]. 그러나 이 두 단백질만을 기반으로 한 MSC의 치료 효과를 설명하기 위해서는 항염증 상태로의 전환에 대한 현재 이해가 불충분하며 신호 전달 메커니즘에 대한 연구가 필요합니다. MSC에 의해 유도된 대식세포 분극에 관여하는 추가 단백질을 확인하고 항염증을 강화하는 신호 전달 메커니즘을 규명해야 합니다.

본 연구에서는 염증성 질환 치료에 효과적인 고효율 줄기세포를 선별하기 위해 MSC에서 분비된 단백질을 질량 감식을 진행하여 PTX3(PTX3/TSG14, 펜트락신 관련 단백질 PTX3/종양괴사인자 유도 유전자 14 단백질)를 잠재적 마커로 검증하였다. 대식세포 분극이 유도되는 신호 전달 메커니즘은 또한 대식세포의 Dectin-1 수용체 매개 mitogen- 및 스트레스 활성화 단백질 키나아제-1/2(MSK1/2) 인산화를 기반으로 규명되었습니다. 또한, 대표적인 염증성 질환인 기관지폐이형성증의 동물모델에서 PTX3와 관련된 치료 효과 및 기전을 시험하였으며, PTX3의 최소 기준을 결정하기 위한 근거를 확보하였다. 염증성 질환에서 MSC의 항염증 치료 기전을 규명하였으며, 우수한 효능을 나타낼 것으로 예측되는 MSC의 선정 기준이 이들 세포의 치료 효과를 높일 수 있음을 확인하였다.

2. 방법2.1. UCB-MSC 준비

이 연구는 MEDIPOST Co., Ltd.의 Institutional Review Board (MP-2015-6-4)의 승인을 받았습니다. 제대혈(UCB)은 신생아 분만 후 정보에 입각한 산모의 동의하에 제대맥에서 채취되었습니다. 수확된 UCB는 채취 후 24시간 이내에 처리되었습니다. Ficoll-Paque™ PLUS(GE Healthcare, Uppsala, Sweden)로 단핵 세포에서 분리 및 분리한 UCB-MSC를 10% 소 태아 혈청(Gibco)이 보충된 최소 필수 배지 알파(Gibco, Grand Island, NY, USA)에서 세척 또는 현탁시켰습니다. 배양액은 5% CO를 함유하는 가습된 분위기에서 37°C로 유지하였다2, 배양 배지를 일주일에 두 번 교체하였다[25]. 각 통로에 대해 MSC를 5일 동안 배양하고, 트립신-에틸렌디아민테트라아세트산(Gibco)으로 수확하고, 계수한 다음, 2,000cells/cm의 세포 밀도로 다시 파종했습니다2. 우리는 Jin et al.의 방법을 따랐다.26]. 이 연구에서 우리는 다른 기증자로부터 얻은 UCB 샘플에서 분리된 7개의 UCB-MSC 로트를 테스트했습니다. 이 셀의 기본 정보는 보충 표에 요약되어 있습니다. 1. 모든 실험에서, UCB-MSC는 통로 6에서 사용되었다. 재조합 PTX3는 R&D Systems(미국 미네소타주 미니애폴리스)로부터 수득하였다.

2.2. 체외 염증 상태

쥐 폐포 대식세포 세포주 NR8383(ATCC, Manassas, VA, USA)을 15% 소 태아 혈청이 보충된 F-12K 배지에서 배양하였다. 리포다당류(LPS, 대장균 O55:B5, 1 μg/mL, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 사용하여 NR8383 세포()를 활성화시켰으며, 이는 염증 상태에 대한 양성 대조군으로 작용했습니다. 고전적으로 활성화된 NR8383 세포를 24웰 플레이트에서 3일 동안 UCB-MSC()와 공동 배양했습니다. 파라크린 작용의 경우 임상 적용 조건과 유사하게 세포 간 접촉(직접)이 사용됩니다. 공동 배양 상층액을 수집하고, 랫트 IL-1α, 랫트 IL-6, 래트 IL-8, 랫트 IL-10 및 인간 PTX3를 효소 결합 면역흡착 분석법(ELISA)으로 측정했습니다(모두 R&D Systems에서). 면역형광 염색의 경우, NR8383 세포를 공동 배양 전에 Hoechst 33342(Invitrogen)로 대조염색한 후 rat CD11b(Abcam, Cambridge, UK), rat CD163(Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA) 또는 rat Dectin-1(Abcam)에 대한 항체로 4°C에서 밤새 배양했습니다. 3회 세척 후, 세포를 Alexa Fluor® 488 또는 Cy3-접합 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd., Newmarket, United Kingdom)로 어두운 곳에서 실온에서 1시간 동안 배양하였다. 형광 이미지는 LSM 800 컨포칼 현미경(Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 획득했습니다.

2.3. 유세포 분석

배양된 세포 표현형의 세포분석 분석을 위해, 인간 CD14 및 CD45에 대한 플루오레세인 이소티오시아네이트-접합 항체 및 인간 백혈구 항원-DR 동형(BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ, USA)에 대해 실온에서 15분 동안 세포를 염색했습니다. 인간 CD73 및 CD166(BD Biosciences) 및 CD90 및 CD105(Invitrogen)에 대한 phycoerythrin-conjugated antibodies. 상응하는 isotype-matched 마우스 항체를 대조군으로 사용하였다. 세포를 인산염-완충 식염수(PBS, Corning, Manassas, VA, USA)로 세척하고, 1%() 파라포름알데히드(Sigma-Aldrich)로 고정하였다. MSC의 면역형은 FACSCalibur 기기(BD Biosciences)에서 유세포 분석에 의해 결정되었으며, 발현된 세포 표면 항원의 비율은 10,000개의 게이트 세포 이벤트[26].

2.4. 세포 분화

세포를 특정 조건 하에서 배양하여 골세포, 연골세포 및 지방세포로의 분화를 유도하고, 이들의 다계통 전위를 앞서 기술한 바와 같이 평가하였다[27]. 간단히 말해서, 골아세포 또는 골세포 형성은 알칼리성 인산가수분해효소(Sigma-Aldrich)의 활성을 측정하여 평가하였다. 연골 분화를 확인하기 위해, 동결 절편을 Safranin O 염색(Sigma-Aldrich)에 의해 분석하였다. 지방세포 형성은 축적된 지질 액포를 Oil red O(Sigma-Aldrich)로 염색하여 평가하였다[26].

2.5. 시크릿 어레이

각 그룹(NR8383 세포 단독 또는 LPS 처리된 NR8383 세포; UCB-MSC 단독 또는 LPS 처리된 NR8383 세포가 있는 UCB-MSC). 단백질 발현 스크리닝은 507개의 항체를 포함하는 차등 스크리닝 항체 마이크로어레이인 Label-Based Human Antibody Array(RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA)를 사용하여 수행되었습니다(Supplementary Table 2). 항체 어레이 실험은 확립된 프로토콜에 따라 E-biogen(대한민국 서울)에 의해 수행되었습니다. 유리 칩이 완전히 건조될 때까지 GenePix 4000B(Axon Instruments, Union City, CA, USA)를 사용하여 형광 검출을 수행하고, GenePix ×4000 스캐너(GenePix 4000B, Axon Instruments)에서 칩을 스캔하고 GenePix Pro 6.0 소프트웨어(Axon Instruments)로 이미지를 분석했습니다. 배경 신호를 빼고 값을 양성 대조군으로 정규화한 후, 어레이 이미지 간 및 어레이 이미지 간의 신호 강도를 비교하여 그룹 간 각 단백질의 발현 수준의 상대적 차이를 측정했습니다(UCB-MSC 단독 대 LPS 처리된 NR8383 세포가 있는 UCB-MSC).

2.6. 정량적 실시간 중합효소연쇄반응(qPCR) 및 소간섭 RNA(siRNA)

qPCR은 LightCycler™ 480 시스템(스위스 바젤 로슈)을 사용하여 수행하였다. TaqMan 프로브는 Universal Probe Library Assay Design Center(Roche, 보충 표 참조)로 설계되었습니다. 3)을 사용하여 PTX3 및 Dectin-1 유전자의 mRNA 수준을 정량적으로 검출합니다. 이들 mRNA의 상대적 발현 수준은 비교 역치 주기 방법(comparative threshold cycle method)을 사용하여 계산하였다(2−ΔΔCT)에서 β-actin mRNA 발현 수준[26]. Dharmacon(미국 콜로라도주 라파예트)은 siRNA 실험에 사용하기 위해 PTX3 siRNA와 스크램블 siRNA를 설계했습니다. siRNA는 제조업체의 지침에 따라 DharmaFECT 1 Transfection Reagent(Dharmacon)를 사용하여 transfection되었습니다. siRNA 풀은 4개의 서로 다른 siRNA 듀플렉스로 구성되었습니다(보충 표 참조). 3).

2.7. 동물 모델

모든 동물실험은 (주)메디포스트 동물관리이용위원회(MP-LAR-2015-12-1)의 승인을 받았습니다. 기관지폐이형성증(BPD) in vivo 모델을 준비하기 위해, 임신한 Sprague-Dawley 랫트(Samtako Bio Korea Co. Ltd., Osan, Korea)는 이전에 보고된 바와 같이 갓 태어난 새끼 랫드를 자연 분만했습니다[28]. 두 가지 실험 설계가 사용되었습니다(보충 표 4). 정상산소 쥐는 정상적인 실내 공기에서 사육된 반면, 고산소 쥐는 출생부터 출생 후일까지 고산소실(90% 산소)에서 자랐다(P) 14. 수유 중인 어미 쥐는 산소 독성을 방지하기 위해 고산소와 실내 공기 깔짚 사이를 매일 번갈아 가며 돌렸습니다. 출생 후 (P) 5에 UCB-MSC를 기관내로 이식하였다[29]. 동일한 부피의 PBS를 대조군으로 척수강내에 주입했습니다. 생존율은 출생 후 14일까지 매일 기록되었습니다. P14에서 새끼 쥐를 깊은 펜토바르비탈 마취(60mg/kg, 복강내)로 희생시키고 형태 측정 및 생화학적 분석을 위해 폐 조직을 채취했습니다. 고정된 폐 조직을 파라핀에 묻히고 4 μm 두께로 절편한 후 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색했습니다. 치조의 정도는 앞서 소개한 바와 같이 평균 선형 지수(MLI)를 사용하여 측정하였다[29]. 쥐 당 최소 3 개의 섹션과 섹션 당 100 개의 필드를 맹검 방식으로 무작위로 평가했습니다. 주입된 MSC의 생착은 Alexa Fluor® 488-표지된 2차 항체(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.)를 사용하여 시각화된 인간 β 2 마이크로글로불린(β2MG, Santa Cruz)의 면역형광 분석에 의해 측정되었습니다. 폐포 대식세포를 검출하기 위해 1차 항체를 사용하여 폐 절편에서 CD11b, CD163 및 Dectin-1을 검출했습니다. 슬라이드를 4°C에서 하룻밤 동안 1차 항체와 함께 배양했습니다. 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 Alexa Fluor® 488 또는 Cy3(Jackson ImmunoResearch Europe Ltd.)로 염색했습니다. 핵은 Hoechst 33342로 대조염색하였다. 단면 이미지는 컨포칼 현미경으로 획득했습니다. 기관지 폐포 세척액(BALF)에서 쥐 IL-6, 쥐 IL-8 및 쥐 IL-10의 농도는 앞서 설명한 대로 ELISA에 의해 테스트되었습니다[28, 29]. 쥐 모델의 기본 체계는 보충 그림에 요약되어 있습니다 1.

2.8. 통계 분석

모든 데이터는 다음과 같이 보고됩니다. SPSS 소프트웨어(버전 18; SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)에 소재한 SPSS, Inc.). 유의한 차이는 분산에 대한 일원 분석과 가장 유의하지 않은 차이 사후 검정을 통해 확인되었습니다. 스튜던트 테스트는 두 그룹 간의 데이터를 비교하는 데 사용되었습니다.  0.05보다 작은 값은 통계적으로 유의한 것으로 간주되었습니다.

3. 결과3.1. UCB-MSC는 체외 염증 모델에서 대식세포 분극을 조절합니다.

MSC는 세포 간 접촉, 성장 인자, 사이토카인, 기질 억제제 및 세포외 소포체를 포함한 수용성 인자의 활성 또는 이러한 메커니즘의 조합을 통해 발생하는 항염증 작용으로 널리 알려져 있습니다[30]. 이전 연구에서는 MSC가 대식세포 분극의 변화를 매개하여 M1 대식세포에서 M2 대식세포를 대안적으로 활성화하여 염증 감소에 기여할 수 있음을 보여주었습니다[13–15]. 대식세포는 전염증성(M1) 또는 항염증제(M2) 대식세포로 분극됩니다. M1 대식세포는 전염증성 사이토카인(IL-1, IL-6, IL-8, TNF-α 또는 IFN-γ)을 방출하여 국소 염증을 유도하는 반면, M2 대식세포는 항염증 효과가 있는 항염증성 사이토카인(IL-10 및 TGF-β 1)을 분비하여 염증 상태에 따른 조직 재생을 가능하게 합니다[16]. M1 및 M2 분극은 M2 대식세포에서 CD86의 높은 발현과 높은 수준의 CD11b 또는 CD163 및 만노스 결합 렉틴 수용체 CD206 및 CD209를 가진 뚜렷한 표면 마커 프로파일을 생성했습니다[17, 18]. 여기에서 UCB-MSC의 대식세포 분극 효과를 분석하기 위해 LPS에 의해 자극된 쥐의 폐포 대식세포(NR8383 세포)를 UCB-MSC와 공동 배양하였다. 배양 72시간 후, NR8383을 M1 전염증 마커(CD11b) 또는 M2 항염증 마커(CD163)로 염색한 후, 양성 세포의 수를 계수하였다. CD11b는 LPS-자극된 NR8383 세포에서 활성화되었다; 그러나 이것은 UCB-MSC와의 공동 배양에 의해 크게 차단되었습니다. NR8383 세포의 CD163 발현은 공동 배양 중에 유의하게 증가하였다(그림 1(ᄀ)). 다음으로 NR8383 세포에서 전염증성 사이토카인(rat IL-1α, rat IL-6, rat IL-8)과 항염증성 사이토카인(rat IL-10) 수치를 분석했습니다. 전염증성 사이토카인의 분비는 LPS 유도 후 증가된 반면, 이러한 증가는 UCB-MSC와의 공동 배양에 의해 현저하게 억제되었습니다. UCB-MSC로 배양한 NR8383 세포의 항염증성 사이토카인 분비는 NR8383 세포 단독의 분비보다 유의하게 높았습니다(그림 1(나)). 이러한 결과는 UCB-MSC가 염증 조건에서 체외에서 대식세포 분극을 촉진한다는 것을 보여줍니다.

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4. 고찰

이 연구에서 UCB-MSC는 PTX3 단백질의 작용을 통해 염증을 억제하고 항염증을 향상시켰으며 염증의 in vitro 및 in vivo 모델 모두에서 대식세포 분극에 영향을 미쳤습니다.

UCB-MSC를 LPS 자극 대식세포와 공동 배양했을 때, 염증성 사이토카인의 현저한 감소와 항염증성 사이토카인의 현저한 증가가 관찰되었습니다. 유사하게, M1 마커인 CD11b가 현저히 감소하고, M2 마커인 CD163이 활성화되었습니다. 최근 보고에 따르면, MSC에 의한 단백질 분비는 대식세포 분극 유도, 염증 억제, 항염증 증진에 관여한다[24]. 염증 상태에서 UCB-MSC가 분비하는 단백질이 대식세포 분극을 유도한다는 예측을 바탕으로 세포 배양 배지를 이용한 507 secretome array를 분석하였다. UCB-MSC 단독 배지와 비교했을 때, LPS 자극 대식세포와 공동 배양된 UCB-MSC 배지에서 192개 단백질 수준이 2배 이상 증가했습니다. 이러한 단백질은 호르몬, 신경 발생, 이동, 성장 인자, 분화, 항산화, 항염증, 항 세포 사멸, 혈관 신생 및 접착을 통한 바이오 프로세싱에 관여하는 것으로 분류되었습니다. 항염증에 관여하는 10가지 단백질(PTX3, TIMP-2, Decorin, Frizzled-1, VEGF, FGF5, FGF-11, ANG-1, TSP-1, Gal3)을 후보로 선정했습니다. TSG6는 선행 연구에서 자주 조사된 바 있습니다[22, 23, 34]는 2배 미만으로 증가했기 때문에 제외되었습니다. PTX3는 가장 큰 증가를 보였기 때문에 잠재적인 마커로 선정되었습니다. 4개 로트를 분석한 결과, 증가율의 차이에도 불구하고 모든 공동 배양 배지에서 PTX3 수준이 뚜렷하게 증가한 것으로 확인되었습니다. 다른 단백질 후보는 추가 분석이 필요합니다. UCB-MSC에서 분비되는 VEGF, TSP-1, Gal3는 다양한 질환의 동물모델에서 치료 효과가 있는 것으로 알려져 있다[35–37]. 따라서, 추가 마커는 추가 연구에서 식별될 수 있습니다. 또한, MSC에 의해 분비되는 파라크린 인자는 전염증성 사이토카인[38–40]. MSC의 파라크린 효과 및 분비 인자의 조절은 MSC의 치료 효과를 결정하는 데 중요했습니다.

PTX3는 대식세포가 항염증 M2로 분극되도록 유도하는 동시에 TGF-β 및 IL-10과 같은 면역억제 사이토카인을 분비하도록 자극하는 것으로 보고되었습니다[41, 42]. 예를 들어, PTX3 수치가 인위적으로 감소된 PTX3 침묵 세포사멸 대식세포를 재조합 PTX3로 처리했을 때, 염증성 사이토카인이 현저히 감소하고 항염증성 사이토카인이 활성화되었습니다[43]. 이 보고서는 PTX3가 염증을 억제하고 항염증을 강화하는 핵심 요소임을 시사합니다. 이를 바탕으로 PTX3 knockdown UCB-MSC를 대식세포와 공동 배양하여 염증성 조건에서 UCB-MSC가 분비하는 PTX3의 항염증 효과를 검증했습니다. 그 결과, 염증성 사이토카인은 감소하고 항염증성 사이토카인은 낮은 비율로 증가했으며, CD11b의 감소는 정체되고 CD163은 증가하는 것으로 나타났다. 대조적으로, 재조합 PTX3를 사용한 LPS 자극 대식세포 치료는 대식세포 분극을 촉진하여 염증을 억제하고 항염증을 강화했습니다. 그 결과 UCB-MSC에 의해 분비되는 PTX3가 대식세포 분극에 중추적인 역할을 한다는 것을 알 수 있습니다.

다음으로, PTX3가 염증성 조건에서 대식세포 분극을 활성화하는 메커니즘을 조사했습니다. PTX3의 동족 수용체는 알려져 있지 않지만, PTX3가 옵소닌의 역할을 발휘하고 염증에서 대식세포의 Dectin-1 수용체를 통해 자이모산의 내재화를 매개한다는 연구 결과가 보고되었습니다[32]. 따라서, PTX3가 대식세포의 Dectin-1과 상호작용한다는 예측에 기초하여, Dectin-1 수용체에 대한 의존성을 조사하였다. Dectin-1 발현 수준은 공동 배양 대식세포에서 분석되었으며 LPS 자극 대식세포보다 공동 배양된 UCB-MSC에서 유의하게 높은 것으로 나타났습니다. 또한, PTX3 siRNA로 처리한 UCB-MSC에서 Dectin-1 발현이 감소했습니다. 이는 PTX3와 대식세포의 Dectin-1 수용체 사이의 연관성을 나타냅니다. 또한 PTX3에 의해 활성화된 Dectin-1이 대식세포 분극을 촉진하는 데 관여하는지 여부를 조사했습니다. siRNA는 대식세포에서 Dectin-1 발현을 억제하는 데 사용되었으며, 이어서 UCB-MSC와 공동 배양되었습니다. 대식세포 분극 수준을 모니터링한 결과, Dectin-1이 억제되었을 때 대식세포에서 분극이 감소하는 것으로 나타났다. 대식세포의 Dectin-1은 MSK1 및 MSK2 인산화를 통해 항염증성 사이토카인을 유도하면서 염증성 사이토카인을 감소시키는 것으로 보고되었습니다[33]. 따라서, MSK1 및 MSK2 활성화 수준은 염증성 상태에서 UCB-MSC와 공동 배양 후 측정되었습니다. 그 결과, UCB-MSC에 의해 유발된 두 단백질의 수치가 증가한 것으로 나타났는데, (1) UCB-MSC에 의해 분비되는 PTX3를 억제하면 대식세포에서 MSK1 및 MSK2 발현이 감소하고, (2) 대식세포에서 Dectin-1을 억제하면 MSK1 및 MSK2 발현이 감소하는 것으로 나타났습니다. MSK1 및 MSK2와의 연관성을 추가로 확인하기 위해 대식세포를 MSK1 및 MSK2 억제제인 SA747651A로 처리했습니다. 그 결과 대식세포에서 염증 억제 감소와 항염증 증진이 확인됐다. 이러한 결과는 염증 상태에서 USB-MSC에 의해 분비되는 PTX3가 대식세포 Dectin-1 수용체를 활성화하여 MSK1/2 신호전달이 대식세포 분극을 긍정적으로 조절한다는 것을 보여줍니다. 많은 연구에서 Dectin-1이 대식세포에서 p38α MAPK 또는 ERK1/2 캐스케이드를 인산화하여 MSK 활성화를 유도한다고 보고했습니다[33, 44–47]. MSK1/2는 또한 잘 알려진 전사 인자인 CREB의 인산화를 유도하여 염증성 사이토카인 수치를 낮추는 동시에 항염증성 사이토카인의 활성화를 조절하는 것으로 알려져 있습니다[33, 46–49].

효능 표지자로서 PTX3의 잠재적 사용을 검증하기 위해 잘 알려진 BPD의 염증성 질환 모델을 사용했습니다. BPD는 대표적인 염증성 질환이다[50] 및 전임상 연구에서 MSC 주입의 치료 효과가 확인되었습니다[28, 29, 51, 52]는 한국과 미국에서 진행 중인 임상시험에서 평가되고 있다[53–55]. 먼저, PTX3 침묵 MSC를 질병 모델 쥐에 주입하고 치료 효과를 모니터링했습니다. 쥐의 생존율은 출생 후 14일까지 모니터링한 후 MLI, M1 및 M2 마커 발현, 대식세포의 Dectin-1 발현, 폐 조직의 잔류 MSC를 분석했습니다. 염증성 및 항염증성 사이토카인의 분비도 폐 BALF에서 측정되었습니다. 그 결과, PTX3 침묵 UCB-MSC에서 치료 효과가 현저히 감소한 것으로 나타났으며, 폐 조직에서 Dectin-1 발현과 잔류 MSC가 가장 낮았습니다. 다음으로, 분비된 PTX3의 농도를 측정하여 치료 효과를 비교하였다. in vitro 염증 조건에서 PTX3 분비 유도 능력에 따라 3개의 로트(MSC5, MSC6, MSC7)를 선정하고 그룹 간 다양한 파라미터를 비교하였습니다. MSC5는 대조군 대비 PTX3 분비 유도 능력이 가장 낮았으며, 폐포 손상 회복, 항염증성 사이토카인 분비, Dectin-1 발현 등에서 치료 효과를 나타내지 않았다. 이에 비해 MSC6와 MSC7은 모든 평가 항목에서 대조군에 비해 높은 수준의 PTX3 분비를 유도하고 유의한 치료 효과를 보였다. 이는 염증성 질환에서 UCB-MSC의 PTX3 분비 수준이 치료 효과를 결정하는 데 필수적인 기준임을 시사합니다.

위에서 설명한 동물 모델 실험은 염증성 조건에서 UCB-MSC가 분비하는 PTX3 수준이 치료 효과를 예측하기 위한 잠재적 마커임을 시사합니다. PTX3 수준의 컷오프 값은 고효율 줄기 세포의 스크리닝에도 유용할 수 있습니다. 이에 따라 최근 연구에서는 MSC에서 발현된 PTX3가 치료 효과를 나타낸다고 보고했습니다. Cappuzzello 등의 연구에 따르면, 피부 결함 모델에서 PTX3가 감소된 MSC를 주입하면 대조군에 비해 상처 치유가 지연되었습니다[56]. Park 등은 허혈성 뇌손상 동물모델에서 MSC를 주입한 후 조직 재생이 촉진되어 염증 반응이 감소했으며, UCB-MSC에서 높은 수준의 PTX3가 분비되는 것으로 확인됨을 발견했습니다[57]. Mauri 등은 급성 폐 손상의 마우스 모델에 MSC를 주입하여 세포 섬유화가 감소하고 폐 기능이 개선되는 것을 관찰한 반면, PTX3가 감소된 MSC를 주입한 그룹은 폐 산소 공급 능력이 감소하고 폐 손상이 회복되지 않았습니다[58]. 이러한 결과는 MSC의 PTX3가 다양한 치료 효과에 관여한다는 것을 시사합니다.

5. 결론

결론적으로 염증 조건에서 UCB-MSC는 PTX3를 분비하여 대식세포의 Dectin-1 수용체를 활성화하고 MSK1/2 신호전달을 유도하여 대식세포 분극을 촉진시킴으로써 염증을 억제하고 항염증을 강화하는 것으로 확인되었습니다. 또한 PTX3는 고효율 줄기세포 스크리닝을 위한 잠재적 마커입니다. 이러한 결과는 난치성 염증성 질환을 치료할 때 줄기세포 치료의 효과를 극대화할 수 있음을 시사합니다.

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