암 정복을 위한 microRNA의 응용 | |||||
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1. 서론 | |||||
포유류의 면역계(immune system)는 일련의 체계화된 과정에 의해 골수에 있는 조혈모세포(hematopoietic stem cells, HSCs)에서 각기 다른 계통(lineage)의 혈구나 골수세포로 분화(differentiation), 증식(proliferation) 한다. 최근 endogenous microRNA들이 면역세포의 발달(development)과 분화, 성숙(maturation) 그리고 면역항상성 (homeostasis)과 면역기능(function)에 결정적인 역할을 한다고 알려져 왔다. Mature miRNA는 short single stranded RNA로 long primary transcripts (pri-miRNAs)에서 일련의 과정들을 거친 후 자생적으로 생성된다. 이들 miRNA은 2011년 11월 현재까지 human miRNAs 2154개(mouse miRNAs 1324개)가 데이터베이스화 되었고 (miRBase database, version 18.0), 이들은 총 인간 게놈의 약 3%를 차지하고 있다. 각각의 mature miRNA은 평균 약 22 nucleotides(nts)의 짧은 길이를 가지기 때문에, 수백 ~ 수천 개의 target messenger RNA(mRNA)들의 3' untranslated region (UTR)에 상보적으로 결합해 target 유전자(gene)의 발현(expression)을 억제한다. 이 miRNA들은 경우에 따라 인간 전체유전자의 30%~92%를 조절하기 때문에, 세포증식(proliferation)과 사멸(apoptosis), 종양형성(tumorigenesis)과 형태발생(morphogenesis), 조혈과정(hematopoiesis)과 면역세포발달 및 분화 등을 포함한 거의 모든 생명현상에 관여함으로써 세포 항상성을 유지한다. 따라서 이들 miRNA의 dysregulation은 부적절한 세포분화와 증식, 세포사멸을 유도해 암(carcer)이나 자가면역질환 (autoimmune disease) 같은 질병을 유발 할 수 있다. 본 리뷰에서는 기존의 연구들을 바탕으로, 면역세포의 발달과 분화를 조절하는 miRNA들과, 이들의 dysregulation이 면역기능과 자가면역질환 또는 혈액암에 미치는 영향을 알아보기로 한다. 그리고 나아가 이들 miRNAs가 새로운 질병 진단 마커 (diagnostic marker)나 유전자 치료 (gene therapy)에 쓰일 수 있는지 그 가능성을 모색해 보기로 한다. | |||||
2. 본론 | |||||
2-1. 마이크로 RNA 생합성 (microRNA biogenesis) | |||||
약 80% 정도의 포유류 miRNA genes은 protein coding 또는 nonprotein coding transcripts의 intron region에 존재하고, 나머지 20%는 noncoding RNAs의 exon region에 존재한다. miRNA genes은 RNA polymerase II에 의해 한 개 이상의 hairpin loop를 가진 long primary miRNA transcripts로 전사되어 double-stranded RNA-binding protein인 DGCR8에 결합한 후, Drosha (RNase III enzyme)에 의해 precursor miRNAs로 잘려진다 [1](그림 1). 최근 다른 종류의 miRNA precursors (mirtrons)가 발견되었는데 이들은 Drosha processing에 필요한 stem-loop가 없어서 spliceosome에 의해 branched pre-mitrons가 만들어진 후, lariat-mediated debranching에 의해 pre-miRNAs를 형성한다[2]. 이들 pre-miRNAs은 Exportin-5에 의해 세포질로 이동된 후, Dicer (RNase III enzyme)와 TRBP (RNA binding protein)에 의해 22 nts 길이의 miRNA/miRNA duplex를 형성한다. 이 duplex 중 한 가닥만이 guided strand로써 Argonaute (Ago) protein에 loading 되어 RNA-induced silencing complex (RISC)를 만들고 target mRNA에 결합하는 mature miRNA가 된다[3]. 이때 miRNA 5' 말단의 2~8 nts seed region이 target gene을 인지(recognition)하는데 중요한 역할을 담당해, seed region과 target gene 사이의 상보적인 염기서열 정도(complementary degree)에 따라 target gene의 translational repression이 일어나거나 mRNA degradation이나 cleavage가 일어난다 (그림 1). | |||||
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(그림 1. Mammalian miRNA biogenesis) | |||||
2-2. 면역계에서의 miRNA의 역할 | |||||
최근 몇 년간, miRNA가 면역세포의 발달뿐만 아니라 선천적인 면역(innate immunity)과 후천적인 면역(adaptive immunity), 자가 면역 (autoimmunity)등에서도 중요한 역할을 한다고 알려져 왔다. 그 중 활발한 연구가 이루어지고 있는 대표적인 miRNA들과 이들 immunity와의 관련성에 대해 알아보도록 하자. 2-2-1) innate immunity와 miRNAs regulation Innate immune system은 다양한 항원에 대한 특이성을 보이는 adaptive immune system보다 specificity가 떨어지지만, 넓은 범위의 pathogens의 침입에 일차적으로 반응하는 신체의 방어체계이다. Natural killer (NK)cells, mast cells, granulocytes (neutrophils, eosinophils, basohils) macrophages, dendritic cells등이 여기에 속하는데, 다양한 miRNA들이 이들 세포들의 발달과 분화 그리고 면역반응을 조절한다 (그림 2). 일례로 miR-223은 granulocyte-monocyte progenitor(GMP)에서 granulocyte로의 분화 과정 중에 발현량이 증가되어 과도한 granulopoiesis을 억제한다. 따라서 miR-223가 knockout (KO)된 쥐들은 hyperactivity를 가진 mature granulocytes (특히 neutrophil)의 수가 증가해 inflammatory lung pathology를 보인다[4]. 이와 반대로 miR-17-5p, miR-20a, miR-106a들은 monocytopoiesis의 positive regulator로써 GMP에서 monocyte-macrophage로의 분화과정에서 발현량이 떨어져 있다. 따라서 이들의 target gene인 acute myeloid leukemia-1 (AML-1)이 upregulation되어 macrophage colony-stimulating factor receptor (M-CSFR)의 발현을 촉진해 결국 더 많은 monocyte-macrophage differentiation과 maturation이 일어나게 된다[5]. miR-150은 immature HSC에서는 발현량이 낮다가 mature NK cell에서 그 양이 증가해 NK cell의 발달과 분화에 positive regulator 역할을 한다. miR-150은 proto-oncogene인 c-myb를 targeting하는데 miR-150 transgenic mice에서는 NK cell development가 증가한 반면, miR-150 KO mice에서는 NK cell 수가 감소한다[6]. 또한 NK 세포의 활성단계에서 miRNA 기능 연구는 주로 miRNA 유전체 분석을 통한 세포독성 (cytotoxicity)과 cytokine 합성에 관해 연구되었다. 최근 우리 실험실에서는 miR-27a*가 perforin1와 granzyme B의 발현을 저해함으로써 NK 세포 독성을 저해한다고 발표하였다 [7]. 이제 분화가 끝난 mature cells에서 miRNAs와 immune response와의 연관성에 대해 알아보기로 하자. mature monocytes는 membrane에 Toll-like receptors (TLRs)를 가지고 있어 다양한 pathogen-associated molecular patterns (PAMPs)과 inflammatory cytokine stimulation에 반응한다. Human monocyte cells에 bacterial components인 lipopolysaccharide (LPS), peptidoglycan와 proinflammatory cytokines인 interleukin 1 (IL-1)와 tumor necrosis factor (TNF)를 처리하면, miR-146a가 급격히 증가한다. 발현이 증가한 miR-146a는 TLR signaling의 downstream genes인 TNF receptor-associated factor 6 (TRAF6) 와 IL-1 receptor-associated kinase 1 (IRAK-1)을 targeting해서 억제시킨다. 결과적으로 miR-146a는TLR signaling pathway의 negative regulator로 작용해 과도한 염증 반응으로부터 세포를 보호한다[8]. miR-155 역시 macrophage에 bacteria나 virus에서 유래된antigen을 처리하면 그 발현이 증가되어 TLR signaling에 중요한 adaptor protein인 myeloid differentiation primary response protein 88 (MyD 88)을 targeting해서 그 발현을 억제하는 TLR signaling의 negative regulator로 작용한다[9]. 또한 LPS를 처리한 human mononuclear cells에서는 miR-21의 발현이 증가해 proinflammatory tumor suppressor인 PDCD4를 targeting하는데 그 결과 nuclear factor-kB (NF-kB) activation이 떨어지고 anti-inflammatory cytokine인 IL-10 생성이 증가해 전반적인 염증 반응이 저해된다[10]. miR-147 역시 TLR stimulation에 그 발현이 증가되어 쥐의 lung에 존재하는 macrophage에서 과도한 염증반응을 저해한다. miR-9은 neutrophil와 macrophage에서 LPS에 의해 유도된 후, NF-kB dependent immune response를 억제한다. 반면 Let7i 와 miR-125b는 LPS나 기생충 감염에 의해 발현량이 떨어져서, target gene인 MyD88와 TNF를 각각 upregulation하여 innate 면역반응이 증가하게 된다 (그림 2). 결과적으로 서로 다른 miRNAs들이 적절한 수의 innate immune cells을 형성하기 위해 그들의 분화과정에 관여하고, 또한 면역반응 정도를 조절하는 fine tuning으로써 pathogen의 종류나 세포에 따라 서로 다른 miRNAs의 발현량이 증가 또는 감소되어 자극에 의한 염증반응의 민감성은 유지하면서 한편으론 과도한 염증반응으로부터 세포를 보호하는 역할을 한다. | |||||
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(그림 2 innate immunity를 조절하는 miRNAs) | |||||
2-2-2) adaptive immunity와 miRNAs regulation 대표적인 cellular adaptive immunity 보이는 면역세포에 T 림프구(lymphocyte)와 B 림프구가 있는데, 다양한 miRNA가 이들 림프구의 발달과 분화과정에 관여한다. 초기 분화단계의 common lymphoid progenitor (CLP)에서 miRNA의 생합성에 중요한 Dicer가 고갈(depletion)되면 T cell development가 저하되어 흉선 (thymus)과 peripheral lymphoid organ에서 T cell 수가 감소한다[11]. 이 경우 B cell development에도 문제가 생기는데 pro-B cell에서 pre-B cell로의 transition이 차단되어, 축적된 pro-B cell의 apoptosis가 증가하고 mature B cell 수가 감소해 생성되는 antibody diversity가 떨어지게 된다[12] (그림 3). | |||||
2-3. 암 전이에서 microRNA의 역할 | |||||
세포의 이동성(migration)과 침윤성(invasion)은 발달과정(developmental process), 항상성(homeostasis)과 같은 세포 내의 주요한 과정에서뿐만 아니라 암의 진행과정에서도 중요한 역할을 하고 있다. 암세포의 전이는 암 치료를 어렵게 하는 주된 이유로 암으로 인한 사망의 주요한 원인이다. 전이는 암세포가 원발암(primary tumor)에서 떨어져 나와 혈관(blood vessel)이나 림프관(lymphatic vessel)을 타고 다른 기관으로 이동하여 다른 암(secondary tumor)을 유발하는 과정을 뜻한다. 이러한 전이는 기저막의 분해(degradation of basement membrane), 침윤, 혈관신생성(angiogenesis), 암세포의 증식(proliferation) 등을 포함하는 복잡한 과정이다. 전이과정은 먼저 암세포가 혈관으로 이동하는 침윤과정(intravasation), 혈관을 타고 이동하는 과정(circulation), 이동하던 암세포가 혈관에서 특정 기관에서 이동하는 과정(extravasation), 그리고 이동한 기관에서 증식하여 전이 암을 형성하는 과정(colonization)으로 나누어진다 [그림 2]. 전이과정은 다양한 유전자의 발현 변화에 의해서 조절되어지며 각각의 전이유전자는 전이과정에 따라 특이적으로 조절된다. 전이과정은 전이되는 기관의 미세환경(microenvironment)에 의해서 결정되어진다는 이론은 1889년 영국의 외과의사인 Stephen Paget에 의해서 보고되었다(“seed and soil" 이론). 그는 900 여개의 암전이를 조사하여 전이는 무작위로 이루어지는 것이 아니고 전이하는 암세포(seed)와 전이될 기관의 미세환경(soil)에 의해서 결정되며 두 가지 조건이 충족되어야 전이가 일어난다고 주장하였다 [4]. | |||||
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(그림 3 adaptive immunity를 조절하는 miRNAs) | |||||
넓은 범위의miRNAs 생성에 관여하는 Dicer depletion과 달리 lymphocyte development을 조절하는 specific miRNA을 살펴보면 다음과 같다. miR-17~92는 CLP에서 과발현되어 이들 progenitor cells의 survival과 cell cycle을 향상시켜 mature lymphocytes로의 분화를 촉진한다. 이 과정에서 miR-17~92는 상호연관성이 있는 여러 유전자들을 targeting하는데, 첫째로 tumor suppressor gene인 Pten (phosphatase and tensin homolog)와 pro-apoptotic gene인 Bim을 targeting해서 apoptosis를 저해하고 Akt pathway를 활성화시켜 cell cycle와 proliferation을 증진한다 (그림 4). Akt는 glycogen synthase kinase (GSK3β)와 Foxo (Forkhead box class O)을 인산화시켜 그들의 inactivation을 유도해서 그들의 downstream genes인 cyclin D가 안정화되고 p27과 p21는 감소되어 그 결과 G1/S transition이 증가한다[13](그림 4). | |||||
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miR-181는 반대로 CLP단계에서는 낮게 발현하다 CD19+ (cluster of differentiation) B cell 이나 CD4+ CD8+ double positive (DP) thymocytes에서 발현이 증가한다. miR-181a는 TCR signaling에서 negative regulator로 작용하는 phosphatase인 PTPN22와 DUSP5/6를 targeting해서 억제한다. 그 결과 ERK1/2의 활성이 증대되고 이는 T cell receptor (TCR) signaling strength 와 sensitivity 증가로 이어져 DP thymocyte의 다음 분화 단계인 positive selection에서 우위를 점하게 된다[14] (그림 5). | |||||
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(그림 5 miR-181와 TCR signaling 조절) | |||||
miR-150은 progenitor에서는 발현이 낮다가 mature B 와 T cells에서 과발현된 후, naive T cells에서 effector T helper type 1 (Th1) 과 type 2 (Th2)으로 분화한 후에는 발현량이 급감한다. 따라서 miR-150을 조혈모세포에 인위적으로 과발현시키면 T cells, granulocytes, macrophage maturation에는 큰 변화가 없으나, 전사인자인 c-myb를 targeting해 pro-B cells에서 pre-B cells로의 분화가 중단되어 mature B cells의 수가 감소한다 [15](그림 3). miR-155는 innate immunity에서는 과도한 면역반응을 시키지만, adapotive immunity에서는 T 나 B lymphocyte 분화단계의 끝부분에 작용해서 그들의 분화와 면역반응을 증진시킨다. 따라서 miR-155는 inflammatory T cells subsets인 Th17 cell과 Th1 cell로의 분화를 촉진하고, mature B cell이 plasma B cell과 memory B cell로 분화하게 한다 (그림 3). 이와 반대로 miR-155 KO mice에서는 miR-155의 target gene인 c-Maf가 증가되어 CD4+ T cell이 편향적으로 Th2 cell로 분화하며 regulatory T cells (Tregs)와 Th17 cell 수가 감소하고, miR-155 KO B cell에서는 IgG class-switched plasma cells과memory cells의 수가 감소해 germinal center response가 떨어지게 된다. miR-155는class switch recombination (CSR)의 negative regulator인 Pu.1을 억제해 class switched plasma B cell 수를 증가시켜 high affinity IgG1 antibodies 많이 생성한다[16](그림 6). 그리고 miR-155는 세포에서 safeguard 역할을 담당해, IgH와 c-myc의reciprocal translocation에 관여하는 activation-induced cytidine deaminase (AID)을 targeting해서 AID mediated oncogenic translocation을 억제한다 [17](그림 6). 끝으로 T cell의 마지막 분화단계에 관여하는 miRNA들에 대해 알아보기로 하자. Tregs은 effector T cells의 활성을 억제해 면역계의 항상성(homeostasis)을 유지하고 self-antigen에 내성 (tolerance)을 띄게 한다. miR-31는 Treg development에 중요한 전사인자인 Foxp3의 발현을 억제해서 Tregs 수를 감소시키고, miR-21은 간접적으로 Foxp3의 발현을 증가시켜 Tregs 수적 증가를 야기한다[18]. miR-146a는 Th1 cells과 Tregs에서 많이 발현되고 Th2 cells에서는 발현이 낮은데, Tregs에서 과발현된 miR-146a가 signal transducer and activator of transcription (STAT)-1을 targeting해서 Th1 responses를 저해한다 [19](그림 3). miR-326는 전사인자인 Ets를 targeting해서 T helper 17 (Th17) cell의 분화를 증진시킨다. 따라서 적절한 miRNAs의 발현이 T 와 B 림프구의 발달과 분화 및 면역기능에 필수적이며, 면역항상성을 유지하기 위해서 이들 miRNA들의 발현이 엄격히 조절되어야 한다. | |||||
2-3. 자가면역에서의 miRNA의 역할 | |||||
신체가 self antigen에 대한 내성을 유지하기 위해서는, 림프구 형성과정에서 생겨난 self-reactive lymphocyte들을 감지해서 제거하거나 비활성 상태로 만들어줘야 한다. miRNA들이 이런 checkpoints 역할을 담당해서 면역계가 항상성과 정상적인 면역기능 유지할 수 있도록 도와준다. 따라서 이들 miRNA들이 dysregulation되면, autoreactive lymphocytes들이 self-tissue들을 공격하는 자가면역질환을 일으키게 된다. 대표적인 자가면역질환에는 전신 홍반성 루프스 (Systemic Lupus Erythematosus, SLE), 류마티스성 관절염 (Rheumatoid Arthritis, RA), 다발성 경화증 (Multiple Sclerosis, MS)이 있는데, 본 장에서는 이들 자가면역질환들과 연관된 miRNA들을 선별해 이들이 자가면역질환들과 어떤 역학관계가 있는지 알아보기로 한다. | |||||
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2-3-2 miRNA와 Rheumatoid Arthritis (RA) RA는 만성적인 염증을 유발하는 자가면역질환으로 주로 관절과 관절주위의 조직에서 발생한다. RA환자는 SLE환자와 달리 miR-146a가 synovial fibroblasts (RASFs), PBMC, synovial fluid, CD4+ T cells, Th-17 cells에서 과발현 되어있고, 이 경우 miR-146a이 일반적인 TLR signaling의 negative regulator로써 작용하기 보다는 target gene인 Fas associated factor 1 (FAF1)을 억제해서 T cell의 survival을 유도하고, Th17 cell로의 분화를 촉진하여 결과적으로 inflammatory cytokine인 TNFα와 IL-17을 많이 생성 하게한다[23]. 그리고 RA환자에서 과발현된 miR-155는 matrix metalloproteinase (MMP)-1와 MMP-3을 억제해서 RASF-mediated tissue damage를 완화시킨다[24]. 이와 반대로 miR-124a는 RA환자의 윤활막세포 (synoviocytes)에서 발현이 떨어져있어서 target gene인 cyclin-dependent kinase 2 (CDK-2)와 monocyte chemoattractant protein 1 (MCP-1)의 발현이 올라가게 된다. CDK-2는 G1/S transition에 MCP-1은 mononuclear phagocyte의 recruitment에 중요해서 결과적으로 세포 증식이 증가하고 관절부위로 mononuclear phagocyte가 모이면서 RA가 발병하게 된다[25]. miR223, miR-16, miR-132등도 RA환자들에서 dysregulation되지만, 이들 miRNAs와 RA 발병과의 역학관계가 아직 명확하게 알려지지 않고 있다. 2-3-3 miRNA와 Multiple Sclerosis (MS) MS는 central nervous system (CNS)의 피막인 myelin sheath에 만성적인 염증이 일어나는 자가면역질환이다. 앞서 언급했듯이, miR-326는 MS환자의 CD4+ T cells에서 과발현되어 Th17 cell로의 분화와 증식을 촉진하고, miR-155는 inflammatory Th1 and Th17 cells의 발달을 촉진해 MS를 유도한다. miR-34a, miR-155, miR-326들 역시 MS lesions에서 과발현되어 macrophages의 inhibitory receptor에 결합하는 CD47을 공통으로 downregulation 해서 macrophages에 의한 myelin의 phagocytosis를 유도한다[26]. 반대로 miR-17-5P와 miR-20a는 MS환자의 whole blood cells에서 발현이 떨어져있지만 target gene과 정확한 기작은 아직 밝혀지지 않고 있다. 마찬가지로 한 연구에서 microarray로 재발단계(relapse status)와 소강단계(remission status)의 MS 환자들의 PBMC를 추출해 정상인과 비교 분석해본 결과, miR-18b, miR-599, miR-96가 MS의 remission에 관련이 있다고 보고하고 있지만, target gene과 MS remission과의 관련성은 아직 추후 연구가 더 필요하다 | |||||
2-4 miRNA와 hematopoietic malignancies | |||||
면역세포의 비정상적인 증식과 만성적인 염증반응은 leukemia나 lymphoma로 발전하기도 한다. 이때 다양한 miRNA들이 관여하지만 본 장에서는 대표적으로 2가지 miRNA를 언급하기로 한다. 앞서 언급했던 miR-17~92 cluster는 proapoptotic Bim을 target해서 면역세포의 apoptosis를 억제하고 Akt를 활성화시켜 cell cycle과 증식을 증가시킨다. 따라서 miR-17~92의 과발현은 과도한 림프구의 세포증식과 자가면역 나아가 c-Myc-mediated lymphomagenesis를 유도한다[27]. 이와 유사하게 miR-155 transgenic mice는 과도한 polyclonal pre-B cell의 증식이 일어나서 B cell malignancy를 유도하기도 한다[28]. | |||||
3. 결론 | |||||
자체적으로 생성된 miRNA들은 그 짧은 길이 때문에 수백 수천 개의 target gene들과 상보적인 염기서열을 이룰 수 있어 거의 모든 생물학적 과정에 영향을 미칠 수 있는 파급력을 가졌다. 하지만 이들의 조절은 on-off switch가 아닌 target protein expression의 fine tuning으로 여러 개의 miRNA들이 공통의 target gene을 조절하기도 하고, 하나 또는 그 이상의 miRNA들이 기능적으로 관련된 여러 target gene들을 동시에 조절해 시너지 효과를 내기도 한다. 이들의 fine tuning은 세포 항상성 유지에 중요해서, 인위적인 miRNA의 제거나 과발현은 정밀한 양을 유지하던 target protein들의 발현량을 변화시켜 세포를 여러 가지 병리학적 상태로 유도한다. 본 리뷰에서는 그 중 면역세포의 발달과 분화과정에 영향을 미치는 여러 miRNA들에 대해 알아보았다. 최근 면역시스템에 영향을 미치는 다양한 miRNA들과 target gene들이 밝혀졌지만, 생물정보학 도구를 이용한 수많은 predicted target genes중에서 생리기능적으로 의미 있는 key miRNA들을 찾아내 그들의 "real" target을 밝혀내는 것은 여전히 쉽지 않은 도전이다. 특히 mature T lymphocytes는 nucleotide deletion, insertion, substitution이 자주 일어나 개개인마다 mature miRNAs의 sequence heterogeneity가 상당하다. 하지만 이 도전들이 의미 있는 이유는 암이나 자가면역질환에서 발견된 dysregulated miRNAs는 다양한 질환들의 진단 마커 (diagnostic marker)로써 활용가능 할 뿐만 아니라, 효과적인 miRNA-based gene therapy에 중요한 단서를 제공할 수 있다. 실제로 최근에 항암효과를 가진 miRNA들을 쥐에 주입해 lung cancer을 치료하려는 시도가 꾸준히 행해지고 있다[29, 30]. 따라서 다양한 부작용이 따르는 전통적인 immune-suppressive therapies가 아닌 환자 개개인의 miRNA들에 바탕을 둔 맞춤형 gene therapy는 향후 자가면역 질환자들과 악성 혈액암 환자들에게 획기적인 치료법이 될 것이다. | |||||
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