플로스 원. 2015; 10(5): e0128078입니다.
2015년 5월 29일 온라인 게시. 도: 10.1371/journal.pone.0128078
PMCID: PMC4449211
PMID: 26024475
인간 제대혈 유래 중간엽 줄기 세포의 조건화된 배지는 MITF의 프로테아좀 분해를 촉진하여 멜라닌 형성을 억제합니다.
김은성,# 1 전홍배,# 2 림훈, 2 신지현, 1 박소정, 1 조윤경, 1 오원일, 2 윤선양, 2 조동형, 1 ,* 그리고 김주연 2 ,*
Dong-Gyu Jo, 학술 에디터
작성자 정보 기사 노트 저작권 및 라이선스 정보 PMC 면책 조항
관련 데이터데이터 가용성 선언문
추상적인
인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(hUCB-MSC)는 항세포사멸 활성과 세포 증식을 하는 다양한 유익한 분자를 분비합니다. 그러나 멜라닌 형성에 대한 hUCB-MSC의 효과는 크게 불분명합니다. 이 연구에서는 hUCB-MSC에서 유래한 조건화된 배지(CM)가 ERK 신호 전달 경로를 통해 소안구 관련 전사 인자(MITF) 발현을 조절하여 멜라닌 형성을 억제한다는 것을 보여줍니다. hUCB-MSC-CM의 처리는 흑색종 세포뿐만 아니라 흑색종 세포에서 알파 멜라닌 세포 자극 호르몬 유도 과다 색소 침착을 강력하게 억제했습니다. hUCB-MSC-CM 치료는 멜라닌 세포에서 ERK1/2 활성화를 유도했습니다. 또한, ERK1/2의 억제는 멜라닌 세포 및 시험관 내 인공 피부 모델에서 hUCB-MSC-CM의 색소 침착 억제 활성을 억제했습니다. 또한 hUCB-MSC-CM으로 처리된 세포에서 프로테아좀 분해를 유발하는 인산화된 MITF의 발현이 증가한 반면 MITF의 발현은 현저히 감소하는 것을 발견했습니다. 이러한 결과는 hUCB-MSC-CM이 ERK 경로 활성화에 의한 MITF 분해를 통해 멜라닌 합성을 현저히 억제한다는 것을 시사했습니다.
소개
멜라닌 형성은 멜라닌 세포에서 멜라닌 합성이 일어나 피부, 머리카락, 눈의 색을 결정하는 과정입니다. 멜라닌은 미용 외관을 위해 인간의 피부에서 중요한 역할을 할 뿐만 아니라 자외선(UV) 조사와 같은 손상을 유발하는 다양한 소스로부터 피부를 보호하는 데 중요한 역할을 합니다[1]. 현재까지 색소 침착에 관여하는 많은 유전자가 확인되었습니다. 그 중 소안구증 관련 전사 인자(MITF)는 멜라닌 형성 및 멜라닌 세포 기능 조절에 가장 중요한 요소입니다[2]. 중요한 것은 MITF가 티로시나아제와 티로시나아제 관련 단백질1/2(TRP1/2)를 포함한 멜라닌 생성 효소의 유전자 발현뿐만 아니라 멜라닌 세포의 발달과 생존을 조절한다는 것입니다[3, 4]. 티로시나아제와 TRP1/2는 모두 멜라닌 합성 조절에 관여하는 속도 제한 멜라닌 생성 효소입니다. 티로시나아제는 멜라닌 생성의 두 가지 초기 단계, 즉 티로신의 3,4-디하이드록시페닐알라닌(DOPA)으로의 수산화와 DOPA의 도파퀴논으로의 산화를 촉매합니다[5]. TRP1/2는 멜라닌 형성에서 추가 산화 단계를 촉진합니다. 따라서 알부틴과 같은 티로시나아제 억제제는 피부 미백제로 간주됩니다[6]. MITF의 발현은 다양한 자극에 의한 transactivation에 의해 조절됩니다. 알파-멜라닌 세포 자극 호르몬(α-MSH), 포스콜린 및 이소부틸메틸크산틴과 같은 순환 AMP(cAMP) 증가제는 MITF의 트랜스활성화를 통해 멜라닌 합성을 촉진합니다[7–9]. 그것의 수용체, melanocortin 1 수용체에 α-MSH의 바인딩은 결국 cAMP 반응하는 성분 의무적인 단백질 (CREB)의 인산화로 이끌어 내는 cAMP 생산 및 단백질 키나아제 A 활성화를 유도하는 adenylyl cyclase를 활성화합니다. CREB와 MITF promoter는 멜라닌 세포 발달에도 관여하는 일부 전사 인자에 의해 조절됩니다[2, 4]. 전사 제어 외에도 MITF의 발현은 인산화 및 수모일화와 같은 수많은 번역 후 변형에 의해 추가로 조절됩니다[10–13]. 주요 신호 전달 캐스케이드인 ERK 경로는 많은 신호 전달에서 기능하며 MITF의 조절에 관여합니다. 실제로, ERK 경로의 활성화는 멜라닌 형성을 증가시킬 수 있습니다. c-Kit 활성화 시 ERK는 세린 73에서 MITF를 직접 인산화하여 라이신 201의 유비퀴틴화 강화를 통해 프로테아좀 분해를 유발합니다[11]. 또한 ERK 경로의 화학적 억제제인 PD98059는 멜라닌 생성과 티로시나아제 활성을 유도합니다[14, 15]. 대조적으로, 글리코겐 합성효소 키나아제 3에 의한 바르덴부르크 증후군 2형(WS2)과 관련된 돌연변이인 세린 298에 대한 MITF의 인산화는 티로시나아제 프로모터에 대한 결합을 향상시킵니다[10].
자외선 조사 및 피부과 질환과 같은 환경적 요인 외에도 여러 사이토카인이 표피 멜라닌 세포의 증식, 분화 및 멜라닌 형성을 직간접적으로 조절합니다[16–18]. 최근 여러 보고에 따르면 피부의 줄기세포에서 분비되는 인자의 다양한 영향이 나타났다. 지방세포 줄기세포에서 유래한 조건화된 배지(CM)는 피부 세포에서 산화 스트레스 및 멜라닌 형성의 감소와 상처 치유 유도를 보여주었습니다[19, 20]. 그러나 인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(hUCB-MSC)가 멜라닌 형성에 미치는 영향은 잘 규명되지 않았습니다. 이 연구에서 우리는 멜라닌 형성에 대한 여러 가지 다른 줄기 세포 소스의 CM의 효과를 평가했습니다. 우리는 hUCB-MSC-CM이 멜라닌 세포의 ERK 활성화를 통해 MITF의 프로테아좀 분해를 통해 α-MSH 유도 색소 침착을 억제한다는 것을 발견했습니다.
재료 및 방법
세포 배양
Melan-a 세포주는 Dr DC Bennett (St. George's Hospital Medical School, London, UK)에 의해 제공되었습니다. B16F1 세포주는 American Type Culture Collection(미국 버지니아주 매너서스)에서 구입하였다. MNT1 세포주는 한국세포주은행(서울, 한국)에서 구입하였다. 중등도 및 짙은 색소를 가진 기증자의 신생아 포피에서 채취한 정상 인간 표피 멜라닌 세포는 Cascade Biologics(미국 오리건주 포틀랜드)로부터 구입하였다. 멜란-a 세포는 10% 소 태아 혈청, 1% 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 및 200nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트가 보충된 RPMI 1640 배지에서 유지되었습니다. B16F1 세포는 10% 소 태아 혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen)이 보충된 Dulbecco의 변형된 독수리 배지(DMEM)에서 유지되었습니다. 정상적인 인간 멜라닌 세포는 인간 멜라닌 세포 성장 보충제 (Cascade Biologics, Inc; 맨스필드, 영국). MNT1 세포는 10% DMEM, 20mM HEPES(Sigma; St. Louis, MO, USA), 20% 소 태아 혈청 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen)을 함유하는 최소 필수 배지(MEM)에서 유지되었습니다. 모든 세포는 5% CO로 유지되었습니다2 37°C의 가습 챔버에서.
hUCB-MSC의 배양 및 MSC의 준비 조건 배지
이 연구는 MEDIPOST Co., Ltd의 Institutional Review Board의 승인을 받았습니다[21, 22]. 신생아 hUCB는 정보에 입각한 산모의 동의하에 탯줄 정맥에서 수집되었습니다. 단핵 전지는 Ficoll-Hypaque 그래디언트(밀도: 1.077g/cm3; 시그마, 세인트루이스, 미주리). 분리된 단핵 세포를 세척하고, 최소 필수 매질(α-MEM; Gibco, Carlsbad, CA)에 10%(v/v) 소 태아 혈청(FBS; Gibco) 및 50mg/mL 겐타마이신(Gibco)을 배양 플라스크에 센티미터 제곱당 5,3,105세포의 농도로 파종하였다. 배양물을 가습된 5% CO에서 37°C로 유지하였다2 일주일에 두 번 중간 변화가 있는 분위기. 1-3주 후, 섬유아세포 유사 부착 세포 콜로니의 단층이 80% 합류에 도달했을 때, 세포를 TrypLE Express(Gibco)로 분리하고, 세척하고, 배양 배지(10% FBS 및 50mg/ml 겐타마이신이 보충된 a-MEM)에 다시 현탁시키고, 과대 배양했습니다. 모든 실험에서 사용된 hUCB-MSC는 통로 6에 있었습니다[21, 22]. 그 후, hUCB-MSCs 유래 CM을 48시간 후에 수거하였다. 이 수집된 수프는 hUCB-MSC-CM(hUCB-MSCs 유래 조건화 배지)으로 정의되었습니다. hUCB-MSC-CM은 원심 필터 장치(미국 매사추세츠주 밀리포어 빌레리카)를 통해 여과하여 제조하고 후속 실험에 사용하기 전에 4°C 또는 -80°C에서 보관했습니다.
시약
α-MSH, 포스콜린, 레스베라트롤(RSV) 및 알부틴은 시그마(미국 미주리주 세인트루이스)로부터 구입하였다. PD98059 Calbiochem(미국 캘리포니아주 라호야)에서 구입했습니다. 3차원 인체 피부 대체물(Melano Derm Tissue)은 MatTek(Ashland, MA, USA)에서 구입하였다. EGFP-융합 MITF cDNA는 Addgene(Cambridge, MA, USA)으로부터 구입하였다.
티로시나아제 활성 측정
Melan-a 세포를 6웰 세포 배양 플레이트에 도말하였다. 24시간 후, 세포는 α-MSH의 존재 또는 부재 하에서 hUCB-MSC-CM 및 레스베라트롤로 처리하였다. 24시간 후, 세포를 트립신화에 의해 수거하고 차가운 PBS로 세척하였다. 세포를 0.1M 인산염 완충액(pH 6.8)과 더 혼합하고 1시간 동안 얼음 위에 방치하여 멜라노솜으로부터 티로시나아제를 방출한 후, 세포를 4°C에서 20분 동안 13,000rpm으로 원심분리하였다. 상층액을 0.2%의 L-DOPA 용액으로 혼합하고 반전시켰다. 혼합물을 37°C 인큐베이터에서 30분 동안 배양한 후, 티로시나아제 활성을 ELISA 리더(Victor X3, Perkin Elmer)로 490nm에서 측정하였다.
멜라닌 함량 측정
표시된 시약으로 처리한 Melan-a, B16F1, MNT-1 및 NHEM을 수집하였다. 그리고 간단히 100°C에서 30분 동안 멜라닌 추출 완충액(10% DMSO를 함유하는 1N NaOH)을 사용하여 세포 멜라닌을 추출하였다. 그런 다음 ELISA 플레이트 리더(Victor X3, Perkin-Elmer)를 사용하여 415nm에서 흡광도를 측정하여 세포 멜라닌 함량을 측정했습니다.
체외 3D 인공 피부 모델(MelanoDerm Tissue Model)
미개발 멜라노덤 조직(MEK-300-B)과 MEK-300-B(EPI-100-LLMM)용 유지 배지는 모두 MatTek Corporation(미국 매사추세츠주 애쉬랜드)에서 구입했습니다. 멜라닌 함량을 측정하기 위해, MelanoDerm 조직을 권장 프로토콜에 따라 미리 따뜻해진 유지 매체를 포함하는 6개의 웰 플레이트에서 배양했습니다. MelanoDerm 조직은 PD98059의 존재 또는 부재에 있는 hUCB-MCS-CM의 대조 매체로 대우되었습니다. 매체는 18-20 일 동안 동일한 CM으로 격일로 변경되었습니다.
웨스턴 블로팅 분석
모든 세포 용해물을 끓이고 단백질 샘플 완충액(62.5mM Tris-HCl, pH 6.8, 25% 글리세롤, 2% SDS, 5% β-메르캅토에탄올, 0.01% 브로모페놀 블루)(BioRad, Hercules, CA, USA)로 제조하였다. 그런 다음 단백질을 추출했습니다. 그리고 단백질을 SDS-PAGE로 분리하여 PVDF 막(BioRad)으로 옮겼다. 차단 후, 멤브레인을 4°C에서 특이 1차 항체로 밤새 배양했습니다. 항-티로시나아제 및 항-TRP1 항체는 V.J. Hearing(NIH, Bethesda, MD, USA)에 의해 기증되었다. 항-MITF (sc-5625) 및 항-GFP (FL) (sc-8334) 항체는 Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA)로부터 구입하였다; 항-인산-MITF(LS-C199259) 항체는 Lifespan Bioscience(Seattle, WA, USA)로부터 구입하였다; 항-인산-p44/42 MAP 키나아제 (p-ERK 1/2) (9101), 항-p44/42 MAP 키나아제 (ERK 1/2) (9102), 항-인산-p38 MAP 키나아제 (Thr180/Tyr182) (p-p38) (9211), 항-p38 MAP 키나아제 (p38) (9212), 항-인산-SAPK/JNK (Thr183/Tyr185) (p-JNK 1/2) (9251) 및 항-SAPK/JNK (JNK 1/2) (9252) 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA)로부터 구입하였다; 항-액틴(MAB1501) 항체는 Millipore (Temecula, CA, USA)로부터 구입하였다. 단백질 검출을 위해, 멤브레인을 HRP-접합 2차 항체(Pierce, Rockford, IL, USA)로 배양하였다.
통계 분석
제시된 막대 데이터는 평균의 표준 오차(S.E.M.)를 보여줍니다. 그룹 간의 유의한 차이는 스튜던트 t-검정을 사용하여 결정되었습니다. 통계적 유의성은 p-값 <0.05로 정의되었습니다.
결과
hUCB-MSC-CM은 멜라닌 세포와 흑색종 세포의 색소 침착을 억제합니다.
hUCB-MSC-CM은 세포 분화 전위 및 면역 조절 활성에 대한 몇 가지 이점을 보여줍니다[23, 24]. 그러나 피부 색소 침착에서 hUCB-MSC-CM의 역할은 잘 설명되지 않았습니다. 멜라닌 형성에 대한 hUCB-MSC-CM의 효과를 해결하기 위해 Melan-a 멜라닌 세포와 B16F1 흑색종 세포 모두 α-MSH로 자극하고 세포를 골수-MSC(BM-MSC), ADIPOCYTE-MSC, 인간 표피 각질세포-MSC(HEK-MSC) 및 hUCB-MSC에서 유래한 CM으로 추가로 처리했습니다. 흥미롭게도, hUCB-MSC-CM으로 배양된 세포는 멜라닌 세포와 흑색종 세포에서 강력한 티로시나아제 억제제인 아르비운(arbiun)의 세포보다 α-MSH 유도 색소 침착을 더 효율적으로 억제했습니다(그림 (그림 1A1ᅡ 그리고 및1B).1ᄂ). 반면, BM-MSC-CM, 지방세포-MSC-CM 및 HEK-MSC-CM은 멜라닌 생성에 유의한 영향을 미치지 않았다(그림 (그림 1A1ᅡ 그리고 및1B).1ᄂ). hUCB-MSC-CM의 반대로 melanogenic 효력을 더 확인하기 위하여는, 우리는 forskolin, Melan-a 세포 및 정상적인 인간적인 표피 melanocytes (NHEM)에 있는 또 다른 유명한 melanogenesis 유도제를 이용했습니다. 이전 결과에 따르면, 포스콜린에 의해 과잉 생산된 멜라닌은 hUCB-MSC-CM에 의해서만 유의하게 억제되었지만, 멜란-a 세포에서 다른 MSCs 유래 CM에 의해서는 억제되지 않았다(그림 1C). 또한, hUCB-MSC-CM은 NHEM에서 포스콜린 매개 색소 침착을 효과적으로 억제했습니다 (그림 1D). 멜라닌 형성은 티로시나아제와 TRP1/2를 포함한 여러 멜라닌 단백질에 의해 조절됩니다. 따라서, 많은 반대로 melanogenic 대리인은 melanogenic 단백질의 활동 또는 표정을 통제한다. 멜라닌 형성에 대한 hUCB-MSC-CM의 효력을 조사하기 위하여는, tyrosinase 활동은 hUCB-MSC-CM 또는 resveratrol (RSV), 유력한 tyrosinase 억제물로 잠복한 후에 α MSH로 자극된 Melan a 세포에서 시험되었습니다. hUCB-MSC-CM의 치료는 멜라닌 세포에서 α-MSH 자극 티로시나제 활성을 RSV와 동일한 정도로 유의하게 감소시켰습니다(그림 2A). 또한, 티로시나아제(tyrosinase) 및 TRP1과 같은 멜라닌 생성 효소의 발현 증가는 또한 hUCB-MSC-CM 처리된 멜라닌 세포(그림 2B). 인간 인공 피부 모델에서 멜라닌 형성에 대한 hUCB-MSC-CM의 효과를 추가로 평가했습니다. 인공 피부 샘플을 13일 동안 hUCB-MSC-CM 또는 RSV로 처리했습니다. 일관되게 hUCB-MSC-CM은 인간 인공 피부 모델에서 RSV와 동일한 정도로 색소 침착을 효율적으로 억제했습니다(그림 (그림 3A3ᄀ–3ᄃ). 종합하면, 이러한 결과는 hUCB-MSC-CM이 멜라닌 세포의 멜라닌 형성을 부정적으로 조절한다는 것을 시사했습니다.
ㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡ
토론
MSC는 자가 재생 능력을 가진 다능성 기질 세포이며 조골세포, 연골세포, 근세포 및 지방세포와 같은 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있습니다[31, 32]. MSC는 배아 조직, 골수, 지방 조직 및 태반과 같은 여러 가지 출처에서 분리할 수 있습니다[33]. 그 중 hUCB는 최근 MSC의 분리 및 수집을 위한 대체 줄기세포 공급원으로 간주되고 있습니다[34, 35]. MSC는 다양한 치료용 단백질을 병리학적 부위로 분비하기 때문에 많은 질병에서 의약품 공장으로 제안되었습니다[21, 34]. 파라크린 작용으로 MSC에서 분비된 분자는 항세포사멸, 증식 자극 및 독성 단백질 제거에 적극적으로 참여합니다[33, 35]. 앞서 hUCB-MSC의 CM에는 성장인자, 사이토카인 등 다양한 유익한 단백질이 함유되어 있음을 확인하였다[21, 22]. 이 연구에서 우리는 hUCB-MSC의 CM이 정상 멜라닌 세포 및 흑색종 세포주에서 MITF 활성을 감소시켜 α-MSH 유도 과색소침착을 효율적으로 억제한다는 것을 추가로 발견했습니다. 그러나, CM 유래 다른 MSC는 멜라닌 형성(그림 1).
hUCB-MSC는 신생아 조직에서 분리되기 때문에 골수, 지방세포와 같은 성인의 다른 공급원에 비해 더 원시적인 MSC입니다. hUCB-MSC는 다른 고령 공급원보다 더 많은 파라크린 인자를 가지고 있습니다[36]. 이러한 원시적 특징과 관련하여, hUCB-MSC는 장기 배양 조건에서 지연된 노화 과정을 보여주었습니다[36]. 노화 관련 분비 표현형(SASP)과 같은 특정 파라크린 인자는 다른 공급원에 비해 hUCB-MSC에서 훨씬 낮습니다[37]. 이전에는 SASP 중 하나로 알려진 인터루킨-1α가 증가하면 티로시나아제 활성이 향상되어 피부 색소 침착이 가속화되는 것으로 보고되었습니다[38]. Kim과 동료들은 adipocyte-MSC-CM이 mouse 흑색종 세포에서 멜라닌 합성과 티로시나아제 활성을 억제하는 반면, MITF의 발현 수준은 adipocyte-MSC-CM에 의해 변하지 않는다는 것을 보여주었습니다[20]. 또한, Hwang 등은 최근 신경줄기세포 유래 CM(NSC-CM)을 처리하면 Wnt 억제제의 활성화에 의해 멜라닌 생성이 억제됨을 밝혔다[39].
항멜라닌 형성에 대한 hUCB-MSC의 효과적인 파라크린 인자를 조사하기 위해 사이토카인 어레이(미공개 데이터)를 포함한 여러 생화학적 접근법을 사용하여 hUCB-MSC-CM을 분석했습니다. NSC-CM 결과에 따라 hUCB-MSC는 Wnt 신호전달 경로와 관련된 다양한 분자도 분비했습니다. 또한, hUCB-MSC에서 형질전환 성장인자-β1(TGFβ1)이 많이 생성됨을 확인했다. TGFβ1은 MAPK 신호전달 경로의 활성화를 통해 멜라닌형성을 억제할 수 있기 때문에 hUCB-MSC-CM으로 처리된 세포에서 MAPK 단백질의 발현을 추가로 평가했습니다. 에서 볼 수 있듯이 그림 4hUCB-MSC-CM의 치료가 ERK 활성화를 유도하여 멜라닌 세포에서 MITF의 프로테아좀 분해를 유도한다는 것을 발견했습니다. 또한, ERK 억제제인 PD98059의 치료는 정상 마우스 멜라닌 세포 및 인공 피부 모델에서 hUCB-MSC-CM에 의한 멜라닌 함량의 감소를 회복시켰다(도 1 (그림44 그리고 및5).5). MITF의 발현은 전사 수준과 번역 후 변형을 통해 조절될 수 있습니다. 활성화된 ERK는 세린 73에서 MITF의 인산화를 자극하여 결국 유비퀴틴-프로테아좀 의존 경로를 통해 분해를 촉진합니다[11, 30]. hUCB-MSC-CM의 치료는 멜라닌 세포에서 MITF의 발현을 하향 조절했습니다. 따라서 TGFβ1 매개 신호전달에 대한 추가 연구는 hUCB-MSC-CM에 의한 멜라닌 형성의 근본적인 조절 메커니즘을 추가로 밝히는 데 도움이 될 것입니다.
결론
결론적으로, hUCB-MSC-CM이 ERK 경로 활성화에 의한 MITF 분해를 통해 멜라닌 합성을 유의하게 억제함을 입증했습니다. 더 많은 분자 메커니즘과 임상 연구가 필요하지만 hUCB-MSC-CM의 적용은 화장품 사용 및 과색소 침착 피부 질환 치료에 큰 가능성을 보여줍니다.
ㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡㅡ