<![CDATA[
<table id=cafe_editor_main_table_color bgColor='#f8fcfc' cellpadding=0 cellspacing=0 border=0 width=100%><tr><td id=cafe_editor_main_table class=text><p><img width="340" class="txc-image" style="clear: none; float: none;" src="https://t1.daumcdn.net/cfile/cafe/1131EE4C4FC2344113" border="0" vspace="1" hspace="1" actualwidth="340" id="A_1131EE4C4FC2344113FF99"/></p>
<p> </p>
<p>먼저 이 실험의 목적을 기억하도록 하자.<br>이 실험의 목적은 면역조직화학법을 이용해서 '<u>단백질X의 발현위치를 확인</u>'하는 것이다.</p>
<p> </p>
<p> </p>
<p>
<hr style="border-width: 1px 0px 0px; border-style: dotted none none; border-color: black; height: 1px;">
<p> </p>
<p><strong>(가) 준비된 2개의 조직 슬라이드(I, II)를 3% 과산화수소수(H2O2)에서 10분간 반응시킨다.</strong></p>
<p> </p>
<p>슬라이드I은 대조군이다.<br>따라서 실험군인 슬라이드 II에 주목할 필요가 있다.<br>(가)과정에서 과산화수소수를 처리한 이유는 조직 시료 내에 이미 존재하고 있는 과산화효소의 활성을 억제하기 위해서이다.<br>왜 과산화효소의 활성을 억제해야 할까? 나중에 (마)과정에서 과산화효소를 처리해서 발색여부를 확인해야 하기 때문이다. 시료 내에 과산화효소가 활성화 상태에 있으면 '추후 처리한 과산화효소의 효과'를 확인할 수 없으므로, 존재하는 과산화효소의 활성을 없앨 필요가 있다.<br>그래야 나중에 처리한 과산화효소의 효과를 명확히 확인이 가능하다.</p>
<p style="text-align: left;"><img src="https://t1.daumcdn.net/cfile/cafe/162FF9434FC83AA42C" class="txc-image" width="348" style="clear: none; float: none;" border="0" vspace="1" hspace="1" actualwidth="348" id="A_162FF9434FC83AA42C953D"/></p>
<p> </p>
<p style="text-align: left;"> </p>
<p style="text-align: left;">
<hr style="border-width: 1px 0px 0px; border-style: dotted none none; border-color: black; height: 1px;">
<p> </p>
<p><strong>(나) PBS로 세척한 후 정상 염소 혈청과 20분간 반응시킨다.<br></strong>bloking과정이다.</p>
<p>염소혈청은 비특이단백질 영역을 코팅하는 역할을 한다(녹색으로 표현).</p><img src="https://t1.daumcdn.net/cfile/cafe/162DC1434FC83AA530" class="txc-image" width="348" style="clear: none; float: none;" border="0" vspace="1" hspace="1" actualwidth="348" id="A_162DC1434FC83AA530C5B0"/>
<p style="text-align: left;"></p>
<p>이 과정이 생략되면 비특이영역에 항체가 결합하므로,</p>
<p>X단백질만을 특이적으로 검출할 수 없고, </p>
<p>
<p>시료가 전체적으로 더 진하고 지저분하게 염색(발색)된다. </p>
<p> </p>
<p>
<hr style="border-width: 1px 0px 0px; border-style: dotted none none; border-color: black; height: 1px;">
<p> </p>
<p><strong>(다) I은 생쥐 면역글로불린과, II는 생쥐 유래 항-X 항체와 각각 1시간 동안 반응시킨다.<br></strong>슬라이드II에 단백질 X에 결합하는 1차 항체(파란색)를 처리하였다. </p>
<p style="text-align: left;"><img src="https://t1.daumcdn.net/cfile/cafe/162FA73D4FC83B5421" class="txc-image" width="348" style="clear: none; float: none;" border="0" vspace="1" hspace="1" actualwidth="348" id="A_162FA73D4FC83B54213CC4"/></p>
<p style="text-align: left;">슬라이드I에서는 단백질X에 특이적으로 결합하는 것이 없다.</p>
<p> </p>
<p style="text-align: left;"></p>
<p>
<hr style="border-width: 1px 0px 0px; border-style: dotted none none; border-color: black; height: 1px;">
<p> </p>
<p><strong>(라) PBS로 세척한 후 바이오틴(biotin)이 부착된 염소 유래 항-생쥐 면역글로불린 항체와 20분간 반응시킨다.</strong></p>
<p>이 단계에서 바이오틴이 있어야 하는 이유는 (마)단계에서 아비딘을 사용하는 것으로 부터 유추할 수 있다.</p>
<p>2차 항체는 염소 유래가 좋다. 왜냐하면 (나)단계에서 비특이영역을 염소혈청으로 코팅하였으므로, </p>
<p>동종유래 항체는 서로 결합하지 않으므로 염소유래의 2차 항체는 비특이영역(녹색영역)에 결합하지 않아 더 specific한 실험 결과를 얻을 수 있다.</p>
<p><img src="https://t1.daumcdn.net/cfile/cafe/1449DE464FC83AF51D" class="txc-image" width="348" style="clear: none; float: none;" border="0" vspace="1" hspace="1" actualwidth="348" id="A_1449DE464FC83AF51D8A47"/></p>
<p> </p>
<p> </p>
<p style="text-align: left;"></p>
<p>
<hr style="border-width: 1px 0px 0px; border-style: dotted none none; border-color: black; height: 1px;">
<p> </p>
<p><strong>(마) PBS로 세척한 후 과산화효소가 부착된 스트렙트 아비딘과 20분간 반응시킨다.<br></strong>아비딘은 바이오틴과 결합한다(지식). </p>
<p style="text-align: left;"><img src="https://t1.daumcdn.net/cfile/cafe/165B39354FC839E729" class="txc-image" width="348" style="clear: none; float: none;" border="0" vspace="1" hspace="1" actualwidth="348" id="A_165B39354FC839E72953E3"/></p>
<p>
<hr style="border-width: 1px 0px 0px; border-style: dotted none none; border-color: black; height: 1px;">
<p> </p>
<p><strong>(바) PBS로 세척한 후 DAB와 반응시킨다.</strong></p>DAB는 발색기질이다. 과산화효소에 의해 분해되어 발색한다.
<p>즉, <strong>발색이 된 부분</strong>은<strong> 단백질X가 존재한다</strong>는 의미이다.</p>
<p style="text-align: left;"><img src="https://t1.daumcdn.net/cfile/cafe/1878C1354FC8398F10" class="txc-image" width="348" style="clear: none; float: none;" border="0" vspace="1" hspace="1" actualwidth="348" id="A_1878C1354FC8398F10C1A3"/></p>
<p> </p>
<p>
<hr style="border-width: 1px 0px 0px; border-style: dotted none none; border-color: black; height: 1px;">
<p><br><strong>(사) 헤마톡실린으로 1분간 염색한 후 현미경으로 관찰한다.<br></strong>헤마톡실린은 핵을 염색한다.</p>
<p> </p>
<p>
<hr style="border-width: 1px 0px 0px; border-style: dotted none none; border-color: black; height: 1px;">
<p> </p>
<p>실험의 목적은 단백질X가 존재하는 위치를 확인하고자 하는 것이고,</p>
<p>발색기질DAB를 넣었을 때 발색이 되는 곳은 곧 X가 존재하는 곳이다.</p>
<p> </p>
<p> </p>
<p> <strong>biosci 님의 답변</strong></p>
<p> </p>
<p> ㄴ. (나) 과정은 blocking 과정입니다. </p>
<p>이 과정을 거치면 (다) 과정에서 항X항체가 조직 시료의 X에 특이적으로 결합하고, </p>
<p>X가 아닌 유사 다른 항원과는 비특이적으로 결합하는 것을 방지해줍니다. </p>
<p>그래서 (나) 과정을 생략하면 항X항체가 비특이적 결합을 하게 되므로 비오틴, 아비딘, DAB 처리 후에 단백질 X가 발현되는 곳에만 깨끗하게 염색되지 않고, 항X항체가 비특이적 결합한 곳에도 염색이 되어 시료가 지저분하게 관찰됩니다.</p>
<p> </p>
<p>ㄹ. (사)에서 헤마톡실린은 핵을 염색시키는 염색약입니다. </p>
<p>따라서 ㄹ지문에서 언급하고 있는 DAB와 관련이 없고, 실험 결과의 슬라이드 1, 2에서 핵이 검게 관찰이 되는 것과 관련있습니다. </p></tr></td></table>
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카페 게시글
☞ 생물:MD·PEET
Re:2012 meet 6번도 질문합니당
飛烏
추천 2
조회 4,708
12.06.01 11:01
댓글 8
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첫댓글 정말 이해 잘되네요~ ㅎㅎ 감사합니다 ㅠㅠㅠㅠ
대박 !! 배우고갑니다
저..ㅜ(라)과정에서 왜 염소유래 항-생쥐 면역글로불린 항체를 쓰는지 여쭤봐도될까요?ㅜ 2차항체를 이용해서 X위치를 찾으려는거면 생쥐 유래 X항체에 결합하는2차항체를써야하는게 아닌가해서요ㅠ..
'염소 유래'를 '생쥐 유래'로 잘 못 쓰셔서 질문하신거죠?
항-생쥐 면역글로불린 항체는 항-X항체에도 결합 할 수 있기 때문입니다.
그런데 항-X항체가 아닌 면역글로불린의 경우 애초에 (다)단계에서 단백질X에 결합하질 못하죠.
따라서 슬라이드1과 슬라이드2에서 다른 결과가 나오게 됩니다.
명쾌한 설명 감사합니다~
감 tothe 동...ㅠㅠ
이때 (나) 과정에서 I에 생쥐 면역 글로불린을 처리하는 이유가 제 머릿속에서 두루뭉실하네용 ㅠㅠ .. 슬라이드II와 비교해서 그냥 생쥐 혈청을 뿌려버리면 염소 혈청과 항원 항체 반응이 일어나서 전부다 결합하는건가요?? 아무튼 슬라이드 1,2 를 비교하기위해 생쥐 면역 글로불린 대조군처리한것은 알겠는데 정확히 왜인지 ㅠㅠ.....
참고] http://cafe.daum.net/S2000/bS7/9169